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重组人钙网蛋白的克隆与原核表达
  • ISSN号:1671-8135
  • 期刊名称:《中国生物工程杂志》
  • 时间:0
  • 分类:Q786[生物学—分子生物学]
  • 作者机构:[1]三峡大学医学院分子生物学研究所,宜昌443002
  • 相关基金:国家自然科学基金资助项目(30772590)
中文摘要:

目的:克隆人钙网蛋白(calreticulin,CRT)并进行原核表达和纯化。方法:采用RT-PCR法从人非小细胞肺腺癌A549细胞总RNA中克隆人钙网蛋白cDNA,构建CRT原核表达质粒(pET-15b/CRT)并转化E.coli的Rossetta菌株。IPTG诱导后,表达蛋白在变性条件下经Ni—NTA树脂亲和层析纯化,然后透析复性。分别用SDS-PAGE和Westem blotting鉴定CRT表达和纯化状态。结果:从A549细胞总RNA中成功获得人CRT cDNA克隆,重组质粒pET-15b/CRT构建正确。转化pET-15b/CRT的E.coli Rossetta诱导性表达重组人CRT蛋白,该蛋白可经Ni-NTA树脂亲和层析高度纯化。结论:成功建立了CRT原核表达和纯化的实验方法,该方法为后续的CRT蛋白功能研究奠定了基础。

英文摘要:

Objective: Clone, express and purify human recombinant calreticulin (CRT). Methods: Human CRT cDNA was amplified from total RNA of human lung cancer cell line A549 ceils by RT-PCR. Then, PCR product was subcloned into prokaryotic expression vector pET-15b. After sequencing, this recombinant plasmid was transformed into E. coli. Rossetta. Recombinant CRT was expressed in host ceils by IPTG induction. Resulted protein was purified by Ni-NTA resin under denature condition and dialyzed to recover its native structure. SDS- PAGE and Western blot method were used to identify the expression and purification of reconbinant CRT. Results: Human CRT cDNA was cloned from total RNA of A549 ceils. CRT prokaryotic expression vector pET-15b-crt was constructed. Reconbinant CRT was induced to express in E. coli and purified by Ni-NTA affinity chromatograph. Conclusion: A method for prokaryotic expression and purification of human recombinant CRT was successfully established. This method laid a foundation for the subsequent CRT research.

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期刊信息
  • 《中国生物工程杂志》
  • 北大核心期刊(2011版)
  • 主管单位:中国科学院
  • 主办单位:中国科学院文献情报中心 中国生物技术发展中心 中国生物工程学会
  • 主编:张树庸
  • 地址:北京市中关村北四环西路33号
  • 邮编:100080
  • 邮箱:biotech@mail.las.ac.cn
  • 电话:010-82624544 82626611-6631
  • 国际标准刊号:ISSN:1671-8135
  • 国内统一刊号:ISSN:11-4816/Q
  • 邮发代号:82-673
  • 获奖情况:
  • 1991年中国科学院科技进步三等奖
  • 国内外数据库收录:
  • 美国化学文摘(网络版),英国农业与生物科学研究中心文摘,波兰哥白尼索引,中国中国科技核心期刊,中国北大核心期刊(2008版),中国北大核心期刊(2011版),中国北大核心期刊(2014版)
  • 被引量:12959