中文摘要：

生物人工肝是目前治疗肝衰竭患者的有效手段，但由于细胞来源困难，限制该治疗手段的进一步发展.本课题拟利用健康人及肝衰竭患者外周血单核细胞诱导出肝样细胞，解决目前生物人工肝发展的瓶颈问题。本研究首先利用成份血采血机对健康人及肝衰竭患者进行外周血单个核细胞（PBMC）采集，贴壁法分离单核细胞，通过M-CSF+IL-3及其它可能的试剂或方法诱导干细胞样细胞，进一步研究该干细胞样细胞的扩增方法及条件，努力扩增至10~100倍，并应用FGF、HGF等高效诱导出肝样细胞，明确所获取的最大细胞数量，对诱导的肝样细胞进行生物学功能鉴定并调整诱导过程，改善肝样细胞功能。利用所获取的肝样细胞建立生物反应器，摸索反应器内肝样细胞的生长条件，应用肝衰竭患者血浆置换废弃血浆进行离体生物人工肝的治疗性实验，检测生物反应器功能，了解肝样细胞在生物人工肝治疗中的作用，为以后临床治疗奠定实验基础。

结论摘要：

肝衰竭是威胁肝病患者生命的严重疾病，目前，肝衰竭的治疗手段主要有三种内科药物治疗、人工肝支持治疗和肝移植治疗。由于供肝严重短缺，肝移植手术的开展受到很大限制，人工肝支持系统在帮助患者度过肝衰竭危险期等待肝细胞再生，或维持患者生存至肝移植方面发挥重要作用，但其发展受限的瓶颈问题就是肝细胞来源问题。本研究拟通过建立肝衰竭患者单核细胞诱导肝样细胞的具体方法和实验步骤，达到从外周血中的单核细胞诱导干细胞样细胞，并能进一步分化成表型和功能都接近肝细胞的肝样细胞。完成的主要内容包括1）单核细胞向单核源性的干细胞样细胞（MoSLC）逆向分化中影响因素的研究。包括逆分化培养基中成分的影响；细胞培养过程影响；扩增培养基的不同配方筛选等。2）MoSLC的评价指标研究。3）MoSLC向MoHLC分化过程中影响因素研究。4）MoHLC的功能研究，通过观察细胞形态变化，细胞培养上清液成分检测等分析MoHLC生物学功能。首先采取20ml肝衰竭病人抗凝血，用淋巴细胞分离液分离出单个核细胞，体外培养2小时后去除未贴壁细胞，贴壁的单核细胞在逆分化培养基（基础培养基加上M-CSF和IL-3等）的培养条件继续培养6天。部分肝衰竭病人的单核细胞在体外可以逆向分化，成为具有多能干细胞特点的可横向分化的细胞(我们定义为单核源性的类肝细胞，Monocyte-derived Stem-like cell, MoSLC)，免疫组化结果显示90％以上的MoSLC表达造血干细胞标志CD34，RT-PCR结果显示MoSLC细胞CD14表达量降低，而CD34表达量增加。此外，MoSLC在肝细胞诱导培养基（肝细胞培养基加上HGF和FGF-4）中培养14天后，部分细胞分化为肝样细胞(我们定义为单核源性的肝样细胞，Monocyte-derived hepocyte-like cell, MoHLC)，细胞形态趋于多边形，且可分泌白蛋白及尿素。RT-PCR结果显示MoHLC表达早期肝细胞标志AFP和CK19。本课题研究单核细胞逆向分化培养基配方，建立一种快速准确的单核细胞向干细胞样细胞逆向分化的诱导方法。国内外首次尝试利用乙型肝炎肝衰竭患者的外周血单个核细胞诱导肝样细胞，目前国内外未见报道，肝衰竭患者病死率高，内科治疗困难，利用自身诱导的肝样细胞进行治疗无疑具有重要的临床意义。