中文摘要：

HPPCn（hepatopoietin Cn）是申请人及所在团队发现和鉴定的新型肝细胞刺激因子，对肝脏再生、纤维化和肿瘤发生等具有重要调节作用。研究表明，HPPCn可以分泌至肝癌细胞的培养上清中，激活受体介导的信号转导通路，从而刺激肝细胞增殖。但蛋白结构分析显示，HPPCn没有信号肽序列，不依赖内质网－高尔基体转运系统出胞，因此推测其为非经典分泌蛋白。作为核蛋白，HPPCn如何到达细胞外，发挥细胞因子功能的机制尚不清楚。本项目拟从HPPCn的蛋白结构特征入手，鉴定其分泌引导序列和核质穿梭序列，探讨HPPCn的定位、分泌与功能的关系；流式、免疫电镜等方法观察HPPCn与膜系统的共定位，分析HPPCn分泌途径及其诱导和调控因素，探讨HPPCn非经典分泌机制及其生物学意义。目前，非经典蛋白分泌的机制还不十分清楚。本研究有利于解释细胞内外物质转运的基本原理，并有助于HPPCn及其拮抗剂的医学应用。

结论摘要：

HPPCn（Hepatopoietin Cn）是申请人及所在团队发现和鉴定的新型肝细胞刺激因子，对肝脏再生、纤维化和肿瘤发生等具有重要调节作用。HPPCn没有信号肽序列，不能通过内质网/高尔基体经典分泌途径分泌，作为一种具有重要生物学功能的细胞因子，其分泌机制尚不清楚。本项目拟分析HPPCn的蛋白结构域、表达定位、分泌途径及其调控等，探讨HPPCn非经典分泌机制及其生物学意义。人多组织芯片分析结果表明，HPPCn在肝和脑组织中高表达，在肝细胞中定位于细胞核，肝癌组织相对于正常肝组织表达水平高。HPPCn及其截短体活细胞成像分析结果提示，HPPCn蛋白C端181-245个氨基酸存在核质穿梭序列，为HPPCn定位于细胞核所必须，而在181氨基酸附近存在维持细胞生存的重要功能序列。双抗体夹心法ELISA分析结果表明，HPPCn 的分泌不被经典分泌途径抑制剂BFA和莫能菌素阻断，属于非经典分泌蛋白。受体竞争结合实验提示肝细胞表面存在HPPCn受体，HPPCn与受体结合后可以激活细胞内多条增殖相关信号通路，并调节细胞内HPPCn的表达水平，因此推测HPPCn以自分泌形式发挥生物学功能。 非经典分泌途径主要分为囊泡运输和细胞表面转运子两类途径。而囊泡运输又分为有酸性小室参与的内体和溶酶体两条途径，以及无需细胞内囊泡参与的外体（exosome）途径。本研究采用Lysotracker细胞内酸性细胞器特异性染料分析EGFP融合HPPCn的分泌途径，结果表明HPPCn与Lysotracker无共定位，说明HPPCn的分泌无需酸性小室参与。因此我们通过高纳米磁珠方法提取肝癌细胞Huh7培养上清中的exosome，western blot分析结果提示HPPCn的以外体途径分泌。其表达和分泌水平被姜黄素刺激增强，但受EGF、TNF-α、IL-1β和TGF-β等多种细胞因子抑制。HPPCn与肝癌、胶质瘤等多种肿瘤的发生和耐药密切相关。本研究不仅有利于解释细胞内外物质转运和肿瘤发生的机制，并有助于HPPCn及其拮抗剂的医学应用。在国内外学术期刊发表论著5篇（已标注基金号），培养研究生1人。