中文摘要：

黑色素是广泛存在于各种生物体内的一类天然色素，能提高生物生存、竞争能力，具有重要的生物学功能和广泛的应用开发价值。中间气单胞菌WS是我们近年来筛选获得的一株新的黑色素高产菌株，已证实该菌的黑色素通过酪氨酸酶途径以L-多巴为中间产物合成。该菌酪氨酸酶的最适作用pH范围及分子量与大多数细菌的同类酶明显不同，编码基因也不符合典型酪氨酸酶的保守序列特征，位于一个推测的操纵子结构中，且含有信号肽序列，并有可能是在周质空间行使跨膜运输功能的双重功能蛋白，后二种情况在细菌酪氨酸酶基因中未见报道。本研究将对该独特酪氨酸酶的基因结构与功能开展系统研究，所获结果在理论上将有助于进一步扩展对细菌酪氨酸酶基本特性及多样性的认识，为黑色素形成途径和生物学功能相关理论体系的完善提供新的实验证据。在应用上还将有助于今后采用基因工程手段获得高酪氨酸酶活力的重组菌株，提高细菌黑色素、L-多巴以及酪氨酸酶的应用、开发水平。

结论摘要：

黑色素是广泛存在于各种生物体内的一类天然色素，能提高生物生存、竞争能力，具有重要的生物学功能和广泛的应用开发价值。中间气单胞菌WS是近年来筛选获得的一株新的黑色素高产菌株，该色素在作为生物农药光保护剂以及防晒化妆品添加剂方面具有应用潜力。此外，一些气单胞菌菌株能引起鱼类疾病，黑色素被认为可能与其致病性有关。但目前对气单胞菌黑色素形成的机理及生物学意义尚了解有限。本研究通过同源重组的方法，对早期认为的WS菌株酪氨酸酶编码基因tryA进行敲除突变，但突变株的产黑能力及多巴活性染色结果与原始菌株相比区别不大，说明tryA可能并非是该菌黑色素形成的关键基因。为确定黑色素形成的分子机理，采取转座子插入突变的方式，从大约2万个突变株中最终筛选获得了12株黑色素合成能力下降的突变株，其中2株突变株基本不形成色素，其余10株色素产量有不同程度的降低。通过tail-PCR结合转座子挽救的方法一共确定了9株色素弱产突变株的突变基因，发现其中5个都与尿黑酸代谢途径有关。进一步通过HPLC技术也确实在WS培养液中同时检测到了多巴和尿黑酸二种中间产物的存在，说明该菌可能同时拥有通过多巴途径合成的真黑素和通过尿黑酸途径合成的脓黑素。结合WS 菌株全基因组测序结果，对预测的尿黑酸代谢途径相关基因与色素形成的相关性进行了验证，发现其中负责催化4-羟苯丙酮酸合成尿黑酸的hpd基因对色素合成至关重要。hpd敲除突变株基本失去了色素形成能力，说明脓黑素才是WS菌株的主要黑色素成分。进一步的分析发现，尿黑酸代谢途径在气单胞菌属中普遍存在，具有色素形成能力的中间气单胞菌WS菌株、杀鲑气单胞菌AB98041菌株，以及不具色素形成能力的嗜水气单胞菌XS91-4-1菌株的hpd基因在大肠杆菌中进行异源表达时均能使后者形成黑色素，说明黑色素在气单胞菌中的形成存在其它的调控机制。我们的研究还发现过氧化氢酶编码基因的缺失会导致WS菌株的多巴途径合成黑色素过程被抑制，说明该酶可能是WS菌株中真黑色素合成的关键酶类。本研究的结果揭示了中间气单胞菌WS菌株黑色素形成的分子机理，扩展了对细菌黑色素形成机制多样性的认识，这为今后进一步探究气单胞菌黑色素的生物学意义特别是与致病性之间的相关性奠定了理论和实验基础。在应用上也将有助于今后采用分子生物学手段提高细菌黑色素的形成能力，提高其应用、开发水平。