中文摘要：

雌激素通过雌激素受体或受体外途径影响多种生理与病理过程，具体作用机制尚未完全明确。一些抗雌激素药物可以阻断氯通道，提示氯通道的开放可能是雌激素作用机制的关键因素。我们前期研究发现雌激素可激活乳腺癌细胞氯通道，且此作用可能是雌激素受体依赖性的。本项目拟用膜片钳、RT-PCR、siRNA干扰、Westernblot、Fret及免疫共沉淀等技术，以氯通道与雌激素-雌激素受体作用的关系作为切入点，重点解决1）雌激素激活氯通道是否经雌激素受体介导；2）雌激素受体介导的氯通道的激活途径，即是通过膜启动的、还是核启动的雌激素应答；3）参与的雌激素受体亚型；4）参与雌激素作用的氯通道分子基础。从氯离子通道角度来探寻雌激素作用的新靶点，拓展对雌激素作用机制的认识，有望为雌激素作用机制提出新观点。

结论摘要：

雌激素通过与雌激素受体（Estrogen Receptor，ER）结合和/或受体外途径参与机体多种生理和病理生理过程，然而机制尚未明确。本项目拟以氯通道与雌激素-雌激素受体作用的关系作为切入点，着重探讨雌激素对氯通道的作用是否依赖于雌激素受体的表达？如果是，何种或哪几种雌激素受体亚型在其中起作用？雌激素激活氯通道的途径是经核启动的应答、还是膜启动的应答？参与雌激素诱导氯电流的氯通道分子基础? 经过3年的努力，按计划顺利完成课题主要的研究内容。17？-E2可成浓度依赖性的激活乳腺癌MCF7（ER？与ER？均阳性）细胞氯电流，该电流可以被雌激素受体（同时也是氯通道阻断剂）tamoxifen所阻断，部分细胞可以被纯雌激素受体抑制剂Faslodex（主要是破坏ER结构和阻断雌激素与ER之间的相互作用）阻断，预先给予Faslodex则使17？-E2对氯电流的激活作用消除，但不能影响低渗激活的氯电流；在不表达ER？，但表达ER？的乳腺癌？DA-MB-231细胞氯通道的活动则不受17？-E2的影响；通过siRNA干扰MCF-7细胞的ER？的表达发现17？-E2敏感的氯电流消失；慢病毒包装质粒转染ER？阴性的？DA-MB-231细胞，使其ER？的表达上调，则可诱导17？-E2敏感的氯电流。上述结果表明雌激素以ER？依赖性的方式激活氯通道。进一步实验发现ER？阳性的MCF-7细胞和ER？阴性的MDA-MB-231细胞表达ClC-2,3,4,5,6,7氯通道，不表达ClC-1氯通道，荧光定量PCR和Western Blot结果显示ClC-3氯通道在MCF-7细胞呈高表达。siRNA干扰ClC-3氯通道蛋白表达后，17？-E2敏感的氯电流消失，抑制了MCF-7细胞增殖，然而对MDA-MB-231细胞几无影响，而转染了ER？的MDA-MB-231细胞增殖则显著被ClC-3 siRNA所抑制。用激光共聚焦显微成像技术观察到17？-E2作用5分钟即可引起ER？和ClC-3蛋白亚细胞定位发生改变，从对照状态时主要分布于核内向细胞膜转移并存在共定位现象。本项目的完成为雌激素作用机制提供新的实验证据，拓展和加深了对雌激素作用机制的认识，ClC-3氯通道蛋白可望作为临床抗雌激素靶向治疗的筛选分子。