中文摘要：

细胞受体是传统化学药物和蛋白药靶，其DNA和mRNA则是基因治疗对象。以RNA为靶的基因药物一直以来都以成熟mRNA为目标，本课题以pre-mRNA为研究对象，基于剪接反应结构序列元件和调节因子相互作用，选择人典型膜受体基因GPA，筛选全长RNA结合靶点，对关键外显子II和内含子I、II的U2snRNP和U1结合剪接点、对外显子II的ESE位点、对内含子I和II的ISE位点三个区域，进行基因靶点发掘确认，合成硫代修饰的反义DNAenzyme分子，转染人K562细胞，分析多靶点DNAenzyme分子单一或组合情形下通过主动切割、消除pre-mRNA剪接后产生的基因失活效果；同时合成各靶点RNA分子，单一或组合导入K562细胞，封闭pre-mRNA剪接来考察靶点阻止剪接、改变基因表达的效果；对培养细胞定性定量分析mRNA剪接形式、表达和蛋白表达，从pre-mRNA靶点出发构建反义基因治疗新方法

结论摘要：

以RNA为靶的基因药物一直以来都以成熟mRNA为目标，本课题以pre-mRNA为研究对象，探讨对pre-mRNA成熟前进行干预是否获得比成熟mRNA干预更为有效的效果。采用实验室的靶点确认技术——固定mRNA分子后和寡核苷酸文库液相杂交淘洗并筛选结合序列、从而筛选靶点并体外进行mRNA分子切割确认，因合成核酸分子难跨膜进入细胞，故分别设计构建靶点Ribozyme质粒（共表达GFP追踪蛋白），用慢病毒转染方式对相应细胞进行转染，以GAPDH内参对照对基因表达的下调效率。采用RT实时Q-PCR、标记抗体对细胞进行标记并用流式细胞仪分析结合Western blot验证表达干预效果。　　首先，对人红系细胞GPA，分别发现靶点在全长基因pre-mRNA中3个，成熟mRNA中2个。经对靶点进行重复验证，并对临近外显子和内含子结合区的靶点进行了剪接增强元件序列、剪接沉默序列比对分析，在体外验证的基础上，确定了5个关键靶点，共同存在于pre-mRNA和mRNA的靶点3条，分别位于第2,3外显子内部。据此3靶点设计的Ribozyme对基因表达干预效果最佳，分别为mRNA水平表达为25%，12.9%和10.9%，蛋白水平表达为23%，10.8%和12%。　　其次，再对人淋巴细胞抑制性受体——程序性死亡受体PD-1基因，分别筛选有效靶点，在全长基因pre-mRNA中5个，成熟mRNA中5个。经重复验证比对分析，发现mRNA上的3个靶点Ribozyme对基因表达干预效果最佳，分别为mRNA水平表达为25%，33%和19.9%，蛋白水平表达为26%，31%和17%。 结论基于pre-mRNA和mRNA的反义核酸靶点发掘和比较，pre-mRNA靶点中循内含子靶点设计对基因表达下调效果不佳、只有同时位于mRNA上的靶点才有最有效靶点；另外，首次发现处在外显子ESE位置的靶点最优。这对反义治疗技术的设计提供了新的参考线索。 投稿一篇 DNA and Cell Biology，经修回且补充实验数据再投稿。研究内容2012年10月19日参加第八届全国免疫学学术会议交流，参加了中国科技协会2013年5月21日在贵州的第十五届年会，特邀英文报告发言。该项目培养硕士研究生2名，其中一人李菲菲于2013年毕业，一人付辉于2014年毕业。培养本科进修生2名。申请发明专利1项。