中文摘要：

乳腺癌细胞具有显著的遗传不稳定性，近年来所提出的高度致癌DNA双链断裂(DSB)的替代修复机制-alternative-NHEJ（Alt-NHEJ）为阐明其机理指明了新的方向。前期工作通过SILAC稳定同位素标记定量差异蛋白组策略鉴定了Alt-NHEJ候选因子，本项目以此为基础，探讨乳腺癌Alt-NHEJ途径的组成因子并对其各自作用机理作一初步研究。拟通过在乳腺癌细胞中沉默Ku70（NHEJ关键因子，抑制Alt-NHEJ启动）而解除其对Alt-NHEJ的抑制；通过DNA探针pull-down实验、免疫印迹及荧光显像等方法对候选因子的DSB染色质结合能力进行验证，通过RNA干扰、化学抑制、免疫共沉淀、末端连接效率分析等方法对各候选因子功能和相互作用关系进行分析。并检测其对散发和家族遗传性乳腺癌细胞生物学特性及存活的影响。为揭示乳腺癌的发病机制提供新的信息，为探索抗乳腺癌新型药物奠定基础。

结论摘要：

癌症是一种基因疾病。DNA的变异易导致原癌基因的激活和抑癌基因的灭活，从而发生细胞癌变。修复DNA双链断裂（DSB）的Alternative-NHEJ（Alt-NHEJ）途径具有高度错误趋向及致癌性，乳腺癌细胞染色体中存在大量重排，易位倒位等变异，无疑与DNA损伤和细胞对其错误的修复密切相关。本项目旨在探索Alt-NHEJ在乳腺癌中的作用机理。课题主体按照本项目原计划进行，根据实际试验需要有少许改动。通过腺病毒装载的Ku70shRNA在乳腺癌细胞中沉默Ku而解除正常情况下Alt-NHEJ的抑制状态；SILAC稳定同位素标记细胞蛋白并提取DNA结合蛋白，定量差异蛋白组分析法鉴定出Ku70下调后与损伤DNA亲和力增加的蛋白，即Alt-NHEJ候选因子；通过DNA探针pull-down实验、免疫印迹及荧光显像等方法对候选因子进行验证；通过RNA干扰、化学抑制分析各候选因子对Alt-NHEJ修复效率的影响，以及细胞对DSB耐受性等方面影响及分析各候选因子相互作用关系，得到一系列的结果。课题得到Alt-NHEJ候选因子22个，包括已有报道的PARP1及MRE11；验证PARP1及MRE11及目前国内外尚未见任何相关研究的2个因子，证实各因子在Alt-NHEJ活化条件下与损伤DNA亲和力增加；功能分析及进一步的机制研究揭示其参与Alt-NHEJ，此部分研究仍在进行中，尚未完全完成。另外，课题数据支持DNA-PKcs在DSB修复过程中对磷酸化H2AX占主导地位。项目部分结果已发表一篇CSCD论文，修回一篇SCI论文，核心部分待发表。