中文摘要：

声带损伤后固有层细胞外基质的无序沉积及排列紊乱等病生理改变使声带丧失独特的分层结构，影响声带的振动功能，由此导致的发音障碍是目前国内外治疗的难点。目前采用脂肪、筋膜等材料局部植入的方法仅能发挥有限的填充作用，但无法重建声带的精细结构达到最佳功能恢复目的。组织工程学技术通过构建细胞-支架复合物修复损伤或功能衰竭的组织或器官，是促进声带固有层细胞外基质再生的可行方法。我们前期实验显示脂肪间充质干细胞-胶原凝胶复合物具有促进声带再生的潜能。本项目拟利用振动生物反应器体外构建脂肪间充质干细胞-细胞外基质支架复合物，探讨其植入受损声带后促进声带细胞外基质再生和有序化的作用机制应用萤火虫荧光素酶基因示踪干细胞，通过活体动物体内光学成像及免疫组化方法研究干细胞的分化转归特点；通过酶联免疫吸附测定声带细胞外基质的含量改变；并同期研究声带组织黏弹性及振动功能变化情况，为临床治疗声带损伤提供方法和依据。

结论摘要：

本课题应用组织工程学技术，将脂肪间充质干细胞与胶原透明质酸支架材料进行体外联合培养并植入受损声带固有层内，为损伤声带的修复再生提供了可行且有效的方法。我们通过全麻支撑喉镜下声带前中部锐性切除（达声带肌层），建立了声带损伤动物模型，同时进行了脂肪间充质干细胞的体外分离培养，从细胞形态、生长特点，细胞表面标志物及多向分化潜能三方面对其进行鉴定，并成功诱导分化为成纤维细胞、成骨细胞及脂肪细胞。应用绿色荧光蛋白对脂肪间充质干细胞进行标记后，在体外通过气-液界面生物反应器联合培养脂肪间充质干细胞-胶原-透明质酸支架复合物，成功构建了组织工程复合物，并发现干细胞与胶原-透明质酸支架有良好的生物相容性。干细胞及其复合物植入受损声带后显示了其较强大的促进声带修复再生的能力3月内的炎症反应轻，6月时声带表面基本光滑，无瘢痕形成。声带细胞外基质中，胶原在3月内含量明显增多，排列紊乱，但之后下降，12月时含量接近正常并集中分布于固有层中、深层；透明质酸在40天内明显增加，分布至固有层各层，之后逐渐减少，12月时含量接近正常，主要分布于固有层浅、中层；纤维连接蛋白于植入后始终在固有层内散在分布，含量在40天内有增高趋势，后逐渐减少，12月时含量接近正常。激光共聚焦免疫荧光共定位研究干细胞植入后的转化情况，发现其能够持续存在于声带固有层内，并有转化成为成纤维细胞的能力，未发现转化为上皮细胞和肌细胞。我们认为，脂肪间充质干细胞复合物促进声带修复再生的机制可能为以下三点① 脂肪间充质干细胞自身具有促进细胞外基质分泌的能力，表现在脂肪间充质干细胞植入后早期细胞外基质中透明质酸和纤维连接蛋白的含量有明显增加，因此中后期胶原的含量得到了明显抑制，并集中于固有层中、深层内，其他细胞外基质亦在固有层内有序分布。② 脂肪间充质干细胞在植入声带固有层后转化成为了成纤维细胞，而成纤维细胞为声带固有层中分泌细胞外基质的主要细胞，也可能参与了声带损伤后细胞外基质的分泌，与脂肪间充质干细胞具有协同作用，对于保持声带损伤后早期固有层内高水平的透明质酸含量具有重要意义。 ③ 脂肪间充质干细胞-细胞外基质支架复合物的结构模拟了声带固有层的结构，植入受损声带后，胶原、透明质酸支架材料提供了细胞黏附、迁移和分化的有效载体和可靠附着，更有利于声带自身细胞外基质的分泌，对于声带固有层的结构重建及最终的功能恢复有重要意义。