中文摘要：

ASP-RNAi能够选择性地干扰完全匹配的靶基因及其等位基因的表达，该方法为基因诊断及治疗提供了新途径。本研究目的是探讨ASP-RNAi对HBV核苷类似物交叉耐药株的病毒复制与表达的影响。课题组前期已成功构建了3株HBV拉米夫定耐药株的真核稳定表达细胞系，并在此基础上，已将ASP-RNAi技术应用于对HBV拉米夫定耐药株基因表达影响的实验研究中，为进一步研究HBV核苷类似物交叉耐药机制提供了成熟的技术支持。本研究在此基础上欲构建不同类型HBV核苷类似物交叉耐药株全基因真核稳定表达系统，同时将ASP-RNAi应用于该真核表达系统中，通过检测HBV mRNA、DNA载量、s和e抗原表达、细胞周期等指标，从分子水平深入探讨HBV的交叉耐药机制及联合变异对HBV交叉耐药产生的影响,为临床解决交叉耐药HBV的诊断及抗病毒治疗提供新的途径和可靠的实验依据。

结论摘要：

乙型肝炎病毒(HBV)的持续感染是当前极为严重的全球性健康问题之一，也是导致慢性肝病最常见的原因。核苷类似物可有效抑制病毒的复制，但长期应用可产生核苷类似物交叉耐药变异株，交叉耐药变异株的出现严重阻碍了乙肝的有效治疗。在本研究中，我们通过对临床病例资料的整理和筛选，共收集到15位临床患者血清，并从患者血清中获取HBV交叉耐药株DNA，进行全基因克隆和测序，从而分析其变异特点和规律，结果发现HBV RT区次要变异伴随位点rtL269I,rtQ333K,rtH337N的出现可能增强了HBV 交叉耐药变异株在体内的复制能力，并对交叉耐药准种所占比例起到了放大的效果。此后应用定向克隆技术构建了6株HBV 交叉耐药株全基因真核表达质粒，同时采用ELISA、Real-time PCR的方法评测细胞外HBsAg和HBeAg的表达及细胞内HBV DNA复制的稳定性。RNAi己在很多领域显示出对目的基因的清除作用，因此，RNAi也成为治疗HBV感染的一种可选的重要手段。其中等位基因RNAi(allele-specific RNAi:ASP-RNAi)技术是RNAi特异性沉默等位基因的进一步应用，该技术可以在有效抑制变异型基因表达的同时而不破坏野生型基因的表达。因此本研究将ASP-RNAi技术应用在抗HBV核苷类似物交叉耐药问题上，针对交叉耐药型HBV rtM204I变异位点，采用单碱基错配的方式设计19个siRNA（S1-S19），体外观察其对HBV交叉耐药变异株DNA复制与抗原表达的影响。结果发现，其中S7能够同时对HBV交叉耐药株和HBV野毒株产生显著的抑制作用；S3位点在目标mRNA的剪切过程中起着极为重要的生化作用，以上结论为RNAi技术在研究HBV交叉耐药问题上及诊断HBV的耐药性方面开辟了崭新的思路和方法。