中文摘要：

对虾是世界上最具有经济价值的海洋无脊椎动物之一。近年来，对虾病害特别是病毒性疾病的大规模流行，严重制约了对虾养殖业的发展。为了加强对虾生物学与病毒学研究、发展有效的疾病防治策略、促进抗病抗逆新品种培育，建立对虾永生细胞系甚为必要。本项申请拟采取两步转基因法，利用泛嗜性逆转录病毒载体（pantropic retroviral vectors）分别向培养的中国对虾淋巴细胞中导入猿猴病毒40（SV40）大T抗原基因和人端粒酶催化亚基（hTERT）基因，使细胞连续突破永生化进程中的两个限制点，从而获得永生性。本项研究若能达到预期目的，则不仅可成功地解决对虾细胞建系这一世界性难题，而且为建立其它海洋无脊椎动物细胞系提供了一条可行的途径。

结论摘要：

使用PCR方法分别从携带SV40T基因的质粒pLXSN-SV40T和hTERT基因（cDNA）的质粒pCIneo-hTERT中扩增出SV40T基因和hTERT基因，通过双粘端连接法将SV40T基因定向克隆到泛嗜性逆转录病毒载体pLXRN的BamHⅠ/XhoⅠ位点之间、将hTERT基因定向克隆到pLXRN的SalⅠ/HpaⅠ位点之间，构建了重组泛嗜性逆转录病毒表达载体pLXRN-SV40T和pLXRN-hTERT；采用磷酸钙沉淀法将两种重组载体分别与包装质粒pVSV-G共转染GP2-293细胞，制备了携带有SV40T基因和hTERT基因的两种重组病毒颗粒，并依次转导培养的中国对虾淋巴细胞；分别经G418抗性筛选和PCR筛选后，获得SV40T基因和hTERT基因双阳性细胞株，并传代培养。RT-PCR检测结果表明，转基因细胞株表达了SV40T mRNA和hTERT mRNA。端粒重复序列扩增法（TRAP）分析结果表明，转基因细胞株的端粒酶活性明显高于对照细胞株。所获得的转基因细胞株的增殖速度加快、复制寿命延长，并具有转化样细胞的特征；传至23代时，因立克次氏体污染而死亡。