中文摘要：

骨关节炎发（OA）是一种以关节软骨变性、破坏和骨质过度增生为主要特征的慢性关节病，其发病率逐年增加，但发病机制尚不明确。国内外研究及我们的初期研究结果发现在OA发病中存在某些基因低甲基化。本研究拟使用高通量全基因组甲基化芯片检测OA软骨细胞全基因组DNA甲基化表达谱，筛选OA特异性低甲基化基因，并使用碱基特异性酶切反应和基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF）相结合的方法，定量检测低甲基化基因的甲基化位点及甲基化程度；然后通过体外细胞培养诱导低甲基化及小干扰RNA（siRNA）介导的基因沉默技术，分别在mRNA和蛋白两个水平上检测低甲基化基因与OA关节软骨退变的细胞因子（白介素1β及转化生长因子β）及细胞凋亡通路分子（一氧化氮）表达水平的关系，探讨低甲基化基因的生物学功能及在OA发展机制中的作用。为研究OA发病机制提供新的思路，为寻找OA治疗干预的新靶点提供实验依据。

结论摘要：

骨关节炎（OA）病理变化主要是关节软骨的退变及软骨细胞外基质的改变，近年来表观遗传学在疾病的发作用越来越受到人们的关注，但少有关于表观遗传学在OA发病机制中作用的研究。本研究通过使用Illumina Human Methylation 450K BeadChip甲基化芯片检测OA、类风湿关节炎（RA）及正常对照组软骨细胞全基因组DNA甲基化表达谱，筛选了OA异常启动子甲基化表达基因，并进一步探讨其可能在OA发病机制的作用。结果发现（1）OA软骨细胞中存在84个启动子甲基化表达异常的基因，其中显著上调38个基因（低甲基化）、显著下调的46个基因（高甲基化）。挑选OA组低甲基化基因使用亚硫酸氢盐处理后测序方法验证发现肿瘤坏死因子受体相关因子1（TRAF1）、结缔组织生长因子（CTGF）、趋化因子（CX3CL1）在OA组及RA组软骨细胞启动子甲基化的程度明显低于正常对照组。（2）使用RT-PCR检测启动子低甲基化基因及OA发病机制中常见致病因子白介素1β（IL-1β）、转化生长因子β（TGF-β）和一氧化氮合酶（NOS）mRNA表达，发现TRAF1、CTGF、IL-1β、TGF-β和NOS mRNA表达在OA组及RA组表达明显高于对照组（p<0.05）， CX3CL1 mRNA表达在OA组表达明显高于对照组（p<0.05）。（3）使用甲基化抑制剂5-氮杂-2-脱氧胞苷（5-AZA-CdR）刺激对照组软骨细胞72h后，IL-1β、TGF-β和NOS的mRNA及蛋白的表达水平显著升高（p<0.05）；使用5-AZA-CdR刺激OA组和RA组软骨细胞72h后，TRAF1、CTGF、CX3CL1mRNA的表达水平明显升高（p<0.05）。（4）构建pEGF-N1-TRAF1 siRNA，pEGF-N1-CTGF siRNA，pEGF-N1-CX3CL1 siRNA表达质粒和对照空白质粒转染入OA软骨细胞，检测TRAF1、CTGF、CX3CL1 mRNA在转染组与对照空白质粒组及未转染组表达无统计学差异。以上结果提示OA软骨细胞，TRAF1、CTGF、CX3CL1启动子低甲基化可能成为研究OA发病机制的新靶点，同时甲基化异常程度可能参与了IL-1β、TGF-β和NO的表达调控。本研究结果为完善OA发病过程中的表观遗传修饰理论，寻找OA治疗干预新靶点提供了理论依据。