中文摘要：

微生物基因组中含有大量的隐性基因簇，挖掘这些基因簇以获得新颖的天然产物，是目前新药发现领域的一个热点。目前该策略的瓶颈在于缺乏激活沉默隐性基因簇的高效手段。申请人发明的双报告基因引导的突变株挑选技术（Double-reporter-guided mutant selection, dRGMS） 是一种高效挑选靶基因过表达突变株的新方法；该方法整合了传统诱变的力度和现代遗传操作的专一性，在提高抗生素产量的应用中取得了很好的效果。本项目拟以放线菌为研究材料，将dRGMS用于沉默基因簇的激活。首先，以激活变铅青链霉菌中的放线紫红素基因簇为具体材料，通过方法学改进，提高激活阳性率。在此基础上，以棒状链霉菌为具体材料，采用改进的方法对所有聚酮类沉默基因簇进行激活，并通过代谢图谱的比较分析，分离鉴定所合成的化合物。dRGMS方法的成功应用，将为微生物隐性基因簇挖掘提供一种高效的新工具。

结论摘要：

微生物基因组中存在大量的沉默隐性次级代谢产物合成基因簇，激活这些基因簇并进一步获得其合成的小分子天然产物，将为天然药物领域的新药研发提供新颖的化合物库。因而，是目前天然产物领域的焦点。开发靶向特异性的，高效普适的激活方法就显得极为重要。双报告基因引导的突变株挑选技术dRGMS有效的整合了传统诱变的高强度和报告基因指导的挑选高效性，在沉默基因簇激活的初步研究实践中显示了良好的效果。在最初的方法学验证中，以Streptomyces venezuelae ISP5230中的jadomycin基因簇为模式基因簇，并以途径特异性调控基因jadR1和核心结构基因mini pks为靶点，dRGMS实现了高效的激活，激活阳性率分别为100%和80%。在进一步激活隐性基因簇的研究中，激活Streptomyces sp. PGA64中的pga基因簇，得到新化合物gaudimycin D和E。这两个化合物属于(S) fridamycin类化合物。Fridamycin类化合物的生物合成途径一直未见报道，本研究也第一次揭示了它们的生物合成途径。总体而言，dRGMS在沉默隐性基因簇激活中的成功应用，为基于genome minging的天然产物挖掘提供了很好的工具，具有良好的应用前景。