中文摘要：

弧菌病害常给海水养殖鱼类造成严重危害，是影响我国海水养殖业发展的最主要障碍之一，每年造成的经济损失巨大，对弧菌病害的发病机制，尚缺乏深入研究，也缺少有效的防治方法。本项目以病原鳗弧菌的毒力因子金属蛋白酶为目的基因，用PCR定点诱变技术改造金属蛋白酶的活力中心氨基酸编码碱基，研究金属蛋白酶活性和细胞毒性与其结构的关系，筛选出失去细胞毒性并保持免疫原性的金属蛋白酶基因突变体，以此构建能用于鱼类免疫的D

结论摘要：

鳗弧菌是海水鱼类重要的病原菌，胞外金属蛋白酶是其重要的毒力因子。用体外化学修饰研究表明蛋白酶的组氨酸、酸性氨基酸、半胱氨酸是酶活力所必需；将蛋白酶基因克隆构建原核表达质粒pET-24d（+）/vam，PCR定点突变表明His346, His350, Glu370、Glu347被取代时，酶活力完全丧失。Tyr361, His429、Asp417被取代后，酶活力也有较大丢失。纯化后的蛋白酶在43 kDa、36 kDa处有特异带。蛋白酶对细胞的毒性跟酶的活力有关,蛋白酶完全失活的突变体则失去毒性。将无酶活突变体pETm-r-EmpA6连接质粒pEGF-N1，构建成真核表达质粒pEGF-N1-mEmpA6，转染HEK293T和CHO细胞后在24小时后检测到蛋白酶基因的表达。将该质粒以肌肉免疫注射牙鲆，7天后用RT-PCR和Western blot在不同组织检测到蛋白酶基因mRNA和表达蛋白,用ELISA方法可检测到特异性抗体。研究还发现不同来源鳗弧菌有较强致病性，鳗弧菌等四种菌多联灭活疫苗有不同程度免疫预防效果。研究结果对于了解鳗弧菌的致病机制和疾病的防治有重要意义。