中文摘要：

碳代谢抑制蛋白Crc是细菌控制其碳代谢的全局性调控因子。当生长介质中存在多种碳源时,细菌通常选择某一种优先碳源如葡萄糖,同时在Crc参与下抑制其它碳源如苯甲酸等物质的代谢。碳代谢抑制现象广泛存在于肠杆菌属和假单胞菌属,是当前微生物代谢研究的热点和前沿,但Crc是否参与生物固氮的碳氮偶联调控尚未见报道。我们对水稻联合固氮斯氏假单胞菌A1501全基因组分析发现该菌拥有一个与铜绿假单胞菌crc高度同源的基因。同时,A1501表现出典型的碳代谢抑制现象,即葡萄糖或乳酸钠存在抑制苯甲酸代谢。为了揭示A1501碳代谢抑制蛋白Crc的调控机制,本研究通过构建Crc突变株,分析Crc在苯甲酸代谢和固氮过程中的生物学功能；利用表达谱技术研究Crc转录组,分析碳氮偶联调控中可能的Crc靶基因,探讨Crc参与固氮调控的分子机制。此研究成果将为固氮微生物的碳代谢抑制调控及碳氮偶联调控网络的揭示奠定重要的理论基础。

结论摘要：

本项目通过突变株构建、代谢谱分析、酶活测定等方法研究了固氮施氏假单胞菌中碳代谢抑制调控全局性因子Crc在苯甲酸代谢和固氮过程中的生物学功能，同时利用转录组技术开展了Crc在固氮条件下的表达谱分析，查找Crc调控的靶基因，探讨Crc参与固氮调控的分子机制。取得的主要结果如下（1）固氮施氏假单胞菌A1501拥有一个与铜绿假单胞菌crc高度同源的基因，氨基酸序列一致性达86%。构建了该基因的突变株，当葡萄糖与苯甲酸同时存在时，crc突变株中葡萄糖抑制苯甲酸的能力丧失。qRT-PCR分析表明，Crc突变影响了苯甲酸代谢关键基因的表达，推测其调控作用是通过苯甲酸代谢的调控蛋白BenR实现的。此外，还发现Crc的突变影响了细菌的趋化、固氮等能力，说明A1501中Crc功能具有多样性。（2）Crc影响了A1501菌的固氮酶活。与野生型相比，突变株的固氮酶活降低了30%。RT-PCR及PnifH-lacZ启动子活性检测都表明，固氮条件下突变株中nifH基因表达相比野生型剧烈下调，提示我们在A1501菌中Crc可能通过某种尚未发现的方式影响了固氮基因的表达，这个现象在其他微生物中从未报道。（3）为了研究Crc在固氮条件下的全局性调控机制，通过高通量测序手段对野生型和突变株在固氮条件下的转录组进行了测定。分析表明crc突变株与野生型相比共有498个基因转录表现出显著差异，其中108个基因表达明显上调，而390个基因的表达受到显著抑制，表明这些基因受crc的直接或间接影响。转录组分析发现A1501固氮岛内中有51个固氮基因发生显著下调，此外，参与氮代谢调控的关键基因glnK，amtB等也表达下调，这表明Crc可能通过某种直接或者间接的机制影响了氮代谢。（4）进一步分析了潜在靶标基因的Crc结合位点，同事采用大肠杆菌BL21 (DE3)菌株表达了Crc蛋白。为下一步Crc与调控靶标的分子互作研究奠定了基础。本研究成果将为固氮微生物的碳代谢物抑制调控机制及碳氮偶联调控网络的揭示奠定重要的理论基础。