中文摘要：

本项目采用SD大鼠四动脉结扎全脑缺血模型和离体培养SD胎鼠海马神经元,采用免疫沉淀及免疫印迹等方法,研究脑缺血/再灌注诱导PSD-95酪氨酸磷酸化的变化规律及其调节机制；采用放射自显影磷酸氨基酸分析、免疫沉淀和免疫印迹等方法，鉴定Src/Fyn介导的PSD-95酪氨酸磷酸化位点；采用重叠延伸PCR定点突变构建PSD-95突变体,以共转染结合免疫沉淀、免疫印迹和全细胞膜片钳技术观察PSD-95酪氨酸磷酸化对NMDA受体功能的调节作用；最终揭示脑缺血PSD-95酪氨酸磷酸化的病理意义。

结论摘要：

PSD-95募集受体及其下游信号分子，从而在突触后水平对兴奋性信号转导进行整合，不仅参与突触发育和可塑性等正常生理功能的调节，亦与脑缺血等病理过程有关。本项目首次发现脑缺血/再灌注引起PSD-95酪氨酸磷酸化水平升高；缺血后PSD-95的这一磷酸化变化由Src 家族酪氨酸蛋白激酶（SrcPTK）介导，并与NMDA受体和L-型电压门控钙通道的开放有关。体外激酶活性分析、激酶与PSD-95其表达后结合免疫沉淀、免疫印迹技术进一步证实，PSD-95是Src和Fyn激酶的底物。通过构建多种PSD-95突变体，我们鉴定出Y523是Src/Fyn磷酸化PSD-95的主要位点，这一位点的突变影响NMDA诱导的全细胞电流。抑制PSD-95的表达或PSD-95的磷酸化可减少缺血性神经元的死亡，并抑制NMDA受体亚基NR2A的磷酸化。以上结果表明，酪氨酸磷酸化是PSD-95的重要调节方式，脑缺血/再灌注PSD-95被SrcPTK磷酸化,导致NMDA受体过度活化，从而引起神经元损伤。这一新的突触后兴奋性信号调节机制的深入阐明，将为缺血性脑病的治疗提供新的策略。