中文摘要：

Necroptosis是一新细胞死亡类型。Nec-1是Necroptosis特异性抑制剂。2005年哈佛大学发现Nec-1具强大保护缺血性脑损伤作用。但Nec-1是否具直接保护神经元和/或星形胶质细胞作用及其信号机制尚有待揭示。预实验结果表明Nec-1对缺糖缺氧（OGD）诱导的原代培养神经元损伤具保护作用；Nec-1抑制脑缺血诱导的Necroptosis关键上游激酶RIP1，并抑制神经元cathepsin L及AIF激活;星形胶质细胞及神经元均含RIP1。据此假设Nec-1抑制缺血性脑中风诱导的神经元和星形胶质细胞Necroptosis，其信号机制是抑制RIP1-cathepsins和/或RIP1-AIF。本课题在小鼠大脑中动脉阻塞及体外原代培养神经元及星形胶质细胞OGD模型上采用RNA干扰及电镜等技术研究Nec-1抑制缺血性脑中风诱导神经元和星形胶质细Necroptosis及其信号机制。

结论摘要：

本项目按研究计划顺利全部执行完成。 Nec-1为necroptosis的关键上游激酶receptor-interacting protein 1 kinase (RIP1K)的特异性抑制剂。虽然近几年来发现Nec-1具有保护缺血性脑损伤的作用，但对其作用机制的研究，尤其是Nec-1保护缺血性神经元及星形胶质细胞的作用机制研究尚少。本项目利用大鼠永久性大脑中动脉阻塞脑缺血模型（pMCAO）及体外原代培养大鼠大脑皮层神经元及星形胶质细胞缺糖缺氧（OGD）模型，发现（1）RIP1K及RIP3K在正常大鼠大脑皮层中均有少量表达，其中RIP1K在星形胶质细胞中表达明显高于神经元，而RIP3K在神经元及星形胶质细胞中的表达均较少。（2）pMCAO 或OGD诱导缺血区或神经元及星形胶质细胞中RIP1K，RIP3K及RIP1K-RIP3K相互作用增加；shRNA RIP1K或Nec-1能降低缺血区或神经元及星形胶质细胞中RIP1K水平及RIP1K-RIP3K相互作用。（3）shRNA RIP1K或Nec-1均可减少小鼠或大鼠pMCAO所致的脑梗塞体积，显著改善神经症状，且Nec-1具有较宽的治疗窗。Nec-1能减少pMCAO诱导的神经元及星形胶质细胞坏死。Nec-1及敲低RIP1K均能增加pMCAO诱导缺血性大脑皮层Map2及GFAP减少。（4）shRNA RIP1K or Nec-1对OGD诱导的神经元及星形胶质细胞损伤具有直接保护作用。（5）shRNA RIP1K or Nec-1抑制OGD诱导的神经元及星形胶质细胞自噬激活，溶酶体酶cathepsin B的激活及从溶酶体释放到细胞浆，并抑制溶酶体膜的不稳定性。（6）抑制溶酶体酶cathepsins保护缺血性脑损伤机制与抑制t-Bid-线粒体凋亡途径有关。（7）Nec-1与自噬抑制剂或与cathepsin B 抑制剂或与cathepsin L抑制剂合用协同保护OGD诱导的神经元及星形胶质细胞损伤。（8）课题组合成2个Nec-1类似物(E)-2-(3,5–二甲氧基苯亚甲基)-环戊酮（DMBC）及5-(3’，5’-二甲氧基苯甲撑基)-2-硫代-咪唑-4-酮(DTIO)均具有明显的保护缺血性脑损伤的作用，其机制与抑制RIP1K的激活及cathepsin B激活和cathepsin B从溶酶体的释放有关。