中文摘要：

我们的前期研究发现化学合成法合成的vMIP-Ⅱ N端肽可选择性的阻断CXCR4的信号传导而阻断CXCR4/SDF-1轴，通过荷乳腺癌小鼠模型证实了此合成肽的抗乳腺癌活性，并可明显提高基因靶向药物Heceptin的药物敏感性（专利申请已进入实质审查）。通过发酵工艺制备了重组肽，并完成重组肽的表达及分离纯化。本课题主要从三个方面进一步研究⑴阐明重组肽与受体结合模式及作用的信号机制，为临床合理联合药物治疗提供理论基础；⑵通过体内外药效实验筛选高活性的重组肽，并实现大规模制造，降低生长成本；⑶对重组蛋白行99mTc标记，以荷乳腺癌小鼠为模型，通过术前SPECT核素显像和术中手提式γ探测仪定位测定放射性活性，检测标记蛋白的生物学活性及其前哨淋巴结诊断应用价值。目的是得到适于新药报批的抑制乳腺癌转移的高效多肽药物及可用于检测前哨淋巴结转移状况的示踪物99mTc-重组肽。

结论摘要：

本研究前期在安徽省自然科学基金（070413119）资助下，得到vMIP-Ⅱ与CXCR4受体的结合位点。在此研究基础上，本研究首先根据编码vMIP-Ⅱ的ORF K4基因的核苷酸的序列确定了编码vMIP-ⅡN末端21个氨基酸肽的核苷酸序列作为目的基因，构建原核表达重组质粒，进行重组蛋白的诱导表达和纯化，得到的重组肽纯度达99.9%（GST-NT21MP）；其次，以探讨GST-NT21MP阻断SDF-1α/CXCR4生物轴的分子机理为切入点，采用分子生物学技术、激光共聚焦、流式细胞仪、放射性标记、SPECT等手段和体外细胞水平及荷乳腺癌小鼠模型，首次阐明⑴ NT21MP体内外抗乳腺癌的生物学活性SDF-1α显著提高乳腺癌细胞株SKBR-3、MCF-7和4T-1细胞增殖、克隆形成、粘附和诱导趋化能力，GST-NT21MP可显著抑制SDF-1α的效应，从而抑制肿瘤细胞的生长和转移能力。荷乳腺癌小鼠模型实验证实了GST-NT21MP抑制原发瘤的生长及肺转移的形成；⑵ NT21MP作用的分子机制双分子荧光互补（BiFC)分析实验证明了NT21MP与CXCR4特异性结合作用，FITC-NT21MP可与小鼠乳腺癌细胞株4T-1细胞膜上及胞浆内CXCR4受体结合，从而竞争性的抑制SDF-1α/CXCR4的结合，从而阻断了SDF-1α诱导的下游信号分子Src、AKT、ERK1/2、FAK的磷酸化水平，继而下调Bcl-2/Bax表达和胞浆内钙离子浓度，阻断乳腺癌细胞的增殖、黏附、克隆形成、趋化效应和SDF-1α的抗凋亡作用；⑶ NT21MP标记分子的体内生物分布和靶向作用以99mTc标记NT21MP，受体分析显示大结果显示99mTc-NT21MP具有可饱和及抑制的受体结合特性，且亲和力较高， KD=0.4348nmol；99mTc-NT21MP通过尾静脉注射荷乳腺小鼠体内，SPECT显像显示99mTc-NT21MP能迅速靶向肿瘤组织，生理盐水组2h的T/NT达4.65，而NT21MP组T/NT则为1.38；NT21MP治疗组原发瘤乳腺癌细胞的CXCR4表达较生理盐水组下调，且肿瘤生长抑制；⑷ NT21MP通过相关蛋白和miRNA表达谱的改变而逆转乳腺癌耐药；⑸ NT21MP可抑制脑胶质瘤细胞的增殖、迁移、趋化和G0/G1期阻滞。