中文摘要：

本研究将体外原代培养大鼠胚胎大脑皮质神经干细胞（NSCs）；通过RNAi技术对叶酸/同型半胱氨酸(Hcy)代谢循环链关键基因（MTHFR和CBS基因）进行消除或抑制；MTT法、BrdU掺入法、免疫组化双标记及激光扫描共聚焦显微镜检测叶酸及缺乏RNAi阻断两基因后NSC增殖分化情况；同时采用双向凝胶电泳(2-DE)结合基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS），研究叶酸缺乏及RNAi干预对NSC增殖分化过程中蛋白质组图谱变化的影响，寻找组间差异蛋白质，Western blot反向验证。本研究将从细胞分子水平，深入探索叶酸/同型半胱氨酸代谢循环在NSC增殖分化的作用，并揭示遗传因素和营养因素对NSC增殖分化作用的异同点，为高Hcy对胚胎大脑的致畸作用及对成体神经系统损伤机制的研究奠定基础，并为神经发育异常及神经退行性疾病的预防和治疗提供新的思路。

结论摘要：

摘要近年来研究发现，叶酸缺乏和伴随其后的血中Hcy水平增高在神经系统发育中可影响神经可塑性，从而导致神经退行性病变。本研究成功构建了叶酸/同型半胱氨酸(Hcy)代谢循环链关键基因（MTHFR和CBS）特异性的shRNA真核表达载体。MTT法、免疫组化双标记及激光扫描共聚焦显微镜检测结果表明叶酸缺乏及RNAi阻断两基因可显著抑制体外培养的神经干细胞（NSC）增殖，并减少NSC向神经元方向分化。HPLC分析发现各干预组增殖期NSC中Hcy的浓度显著提高。同时采用双向凝胶电泳(2-DE)结合基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS），研究各干预组在NSC增殖过程中蛋白质组图谱变化，共筛选到26个蛋白质差异点，经质谱鉴定其中2个蛋白与线粒体能量代谢有关。进一步鉴定结果表明叶酸缺乏和MTHFR/CBS RNAi降低了（顺）乌头酸水合酶和线粒体呼吸链bc1复合物亚单元2的基因表达水平，抑制了多个线粒体呼吸酶和SOD活性，降低了NSC ATP水平，促进了氧自由基的产生。另外，叶酸缺乏和MTHFR/CBS RNAi改变了分化期NSC与甲基循环途径相关的SAM和SAH含量，降低了Dnmts的活性，故推测线粒体的代谢与DNA甲基化水平均可能在叶酸缺乏及MTHFR/CBS RNAi抑制NSC增殖分化过程中扮演着重要角色。同时，营养因素（叶酸缺乏）和遗传因素（MTHFR/CBS基因表达的降低）抑制NSC增殖分化的分子机制具有许多共同之处，但对于机制中所涉及的线粒体代谢和DNA甲基化的之间关联性还需要进一步探讨。本研究为叶酸缺乏和高Hcy在中枢神经系统疾病发生发展中所起的负面作用提供科学依据，为神经发生异常和神经退行性疾病的预防和治疗提供新的思路。