中文摘要：

在体细胞的超高分辨远场光学显微成像，可以在亚细胞和单分子这样的研究层次，深入组织细胞内部，进行无损实时的直接观测，从而更加准确地阐述生命活动的机理和重大疾病的发病原理，在生理学及病理学研究中具有重要意义。本项目以在体细胞的超高分辨成像研究为目标，结合双光子激发荧光技术(2PEF)和受激激发减损显微方法（STED），发展研究双光子受激激发减损显微成像（2PEF-STED）。2PEF-STED方法既保留了2PEF技术光穿透能力深的特点，同时兼有STED方法超高空间分辨和快速扫描的优点。本项目的创新之处在于将非线性光学2PEF引入到超高分辨显微成像，将超高分辨光学显微的光学穿透性提高到几百微米，从而实现在体细胞的纳米尺度成像。

结论摘要：

针对荧光分子双光子激发态的弛豫特性，提出了一种基于布拉格光声衍射器件的双光子受激发射损耗显微成像（2PE-STED）新方法，并成功搭建了Modulated-2PE-CW-STED显微成像系统。我们利用Modulated-2PE-CW-STED显微成像系统，成功获取了用ATTO 452标记的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞内的网格蛋白的超高分辨率图像，其分辨率小于50 nm。Modulated-2PE-CW-STED具有非线性超高分辨显微成像技术独有的穿透深度深的优势。同时，相比于现有的2PE-STED显微成像系统，大幅提高了显微成像的图像信噪比，简化了实验装置，且操作简单，造价低。本项目通过结合双光子激发荧光技术与受激发射损耗显微技术，发展研究了Modulated-2PE-CW-STED显微成像方法及仪器。双光子荧光激发是一种非线性光学过程，受光散射的影响很小，具有穿透深度深的优势。STED显微成像方法是一种可突破衍射极限的远场荧光显微技术，但是缘于其单光子激发的特性，具有较差的光学穿透性，只能用于组织表面（< 100 μm）的成像。Modulated-2PE-CW-STED显微成像技术，在突破衍射极限的基础上，有望实现生物活体组织的超高分辨层析成像。 Modulated-2PE-CW-STED显微成像技术，引入布拉格光声衍射器件，将连续激光与飞秒激光调制为相同重复频率的同步脉冲激光，实现了一种新的2PE-STED显微成像方法。Modulated-2PE-CW-STED显微成像方法和系统具有如下优势（1）实现了单脉冲激光器的2PE-STED成像，无需复杂的脉冲同步，操作简单，且造价较低；（2）双光子激发脉冲光的重复频率降到1 Mhz以下，荧光分子的荧光量子产率提高了15-25倍，大幅提高了显微成像的信噪比；（3）激光对生物样品有光学损伤效应，而布拉格衍射晶体把连续光调制成脉冲宽度为13 ns的脉冲光，可减少样品受照射的时间，降低样品的光学损伤和荧光漂白效应。本课题组取得了一定的科研成果，迄今为止，本项目在国内外发表并被录用论文2篇，其中SCI收录1篇，国内核心期刊收录1篇；国家专利3篇；国内学术论坛报告1次。同时，本课题组积极与该领域研究小组开展合作交流。