中文摘要：

痕量循环肿瘤细胞（CTCs）与肿瘤的进程和转移密切相关，对其高灵敏度定量检测已成为当前研究的热点。本项目提出一种集多功能免疫磁珠、尺寸筛分上皮肿瘤细胞（ISET）和微流控芯片技术优点为一体的痕量CTCs检测新思路。利用抗生物分子非特异性黏附和高荧光示踪功能的核壳式免疫磁珠与CTCs的特异性结合，实现大体积血液中痕量CTCs的磁控预分离和富集；设计并制作基于高灵敏ISET技术的新型聚氨基甲酸-甲基丙烯酸酯（PUMA）微流控芯片的检测系统，通过微流控芯片中大量微柱间8 μm的间隙反复筛分，实现CTCs快速、高通量分离和分析；建立临床毫升级血液中痕量CTCs（≥1 CTC(s)/mL）的检测新方法，并与临床诊断结果对比。本项目的完成将为痕量循环肿瘤细胞高灵敏度检测提供新方法，为肿瘤转移的早期诊断提供新思路。

结论摘要：

循环肿瘤细胞（Circulating Tumor Cells，CTCs）与肿瘤的进程和转移密切相关，对其高灵敏度定量检测已成为当前研究的热点。本项目建立了一种基于多功能免疫磁珠与适配体功能化磁珠的CTCs检测新思路，结合了尺寸筛分上皮肿瘤细胞（Isolation by size of epithelial tumor cells, ISET）技术、微流控芯片技术和滚环扩增（Rolling circle amplification，RCA）技术的优点，实现了CTCs快速、高通量的分离和分析。通过化学交联反应依次实现CdSe/ZnS量子点、HOOC-PEG-COOH、Anti-EpCAM与磁性微球的共价结合，制备得到微米级的MFIMB（Multifunctional immunomagnetic beads, MFIMB）。Anti-EpCAM与细胞表面抗原的特异性结合作用使得MFIMB在细胞表面富集，通过考察每个细胞表面MFIMB的结合密度，得到MFIMB的最佳反应浓度，从而有效增加MCF-7的体积或径长，为提高微流控芯片筛分CTCs的回收率奠定基础。在我们已有研究的基础上，将微通道延长一倍，设计聚氨基甲酸-甲基丙烯酸酯（Polyurethane-methacrylate, PUMA）新型微流控芯片，可以显著增加微流控芯片的通量。以混合在细胞培养液中的MCF-7为研究对象，在不同流速下考察该系统用于细胞筛分的回收率与处理通量，得到最佳流速，并成功应用于添加痕量CTCs的健康人全血样本检测当中，回收率可达到96%。考虑到DNA适配体具有稳定性高、特异性强、成本低廉等优点，我们进一步制备适配体功能化磁珠（Aptamer functional magnetic beads，AFMB），通过控制RCA反应时间优化适配体功能区的重复次数可提高AFMB与肿瘤细胞的结合能力，有效提高回收率。为了实现肿瘤细胞富集、分离同时的荧光示踪，克服传统金属半导体量子点生物毒性高，荧光强度不够的缺陷，后续试验采用半导体聚合物量子点（Polymer-Dot，Pdot）与铁氧化物磁性纳米颗粒混合制备得到的磁性荧光半导体聚合物纳米球(magnetic-fluorescent semiconductor polymer nanospheres，MF-SPNs)实现荧光示踪。