中文摘要：

荧光探针是探测有关转录,翻译及蛋白质命运和相互作用信息的重要方法.本课题利用激光共聚焦显微镜并结合新型GFP-FRET实时观测植物细胞中钙调素CaM与结合蛋白的相互作用。首先研究一种新的FRET 对:采用第三代YFP抗酸型突变体-citrine ，及单体红色荧光蛋白mrfp（荧光发射波长609nm）,Citrine-mrfp的组合解决FRET 中通用的CFP-YFP对的光谱严重干扰问题。同时选择大豆CaM的两种亚型SCaM1或SCaM4, 及SCaM1的特异性结合肽pepA，植物细胞外CaM结合蛋白-ECBP21，构建含CaM或靶蛋白基因与citrine或mrfp1基因进行重组的质粒，及适合转染植物细胞含35S启动子适合基因枪瞬时表达的PUC质粒。将重组基因在E.COLI中表达与纯化后，进行in vitro FRET分析,利用洋葱表皮细胞的瞬时转染体系进行in vivo FRET 分析.

结论摘要：

鉴定和表征蛋白质相互作用是在分子水平上理解生命运动的前提。荧光蛋白FRET技术能更好地探测体内研究蛋白质相互作用。而目前通用的荧光蛋白FRET对存在着很多缺陷，我们选用几种荧光蛋白MiCy、Citrine、mKO和mRFP来进行新型FRET对的探索。我们的实验从理论分析、体外实验以及体内实验等方面充分论证了它们作为新型FRET对的可行性。理论上这些FRET对的供体荧光量子产率比较高，光谱重叠都比较大，这样就提供了更大的F?rster距离，从而提高了观察相互作用的灵敏度。体外实验中，无论在荧光分光光度计还是在激光共聚焦显微镜下，都能明显观察到FRET现象。在体内实验中，我们检验了新的FRET对，并阐明了CaM4 和ECBP21及SCaM4和CN2在活细胞内的相互作用。最后，我们还探讨了CFP/mKO 和CFP/mRFP作为FRET对的可行性，并研究了AtCaM3 和ECBP21或pepA 在活细胞内的相互作用。我们构建一个新的GFP-活细胞pH指示剂，初步的活体应用于大肠杆菌中pH值的测定。最后，还探讨了FRET实验中，出现假FRET现象的浓度界限以及主要的non-FRET的机制。