中文摘要：

以棉铃虫围食膜蛋白为作用对象；通过比较增效蛋白ENHANCIN处理和非处理组围食膜蛋白的2D电泳找出差异蛋白点，采用串联质谱、N-末端测序、RT-PCR和RACE等技术克隆差异蛋白点的cDNA，进行序列测定及生物信息学分析，确定棉铃虫围食膜上ENHANCIN相关的靶标蛋白谱及其序列特征。利用杆状病毒表达系统表达靶标蛋白，ENHANCIN酶解表达蛋白，2D电泳分离酶解后的肽段，质谱和N-末端测序等技术确定这些肽段的一级结构。根据上述结果，构建靶标蛋白不同特征序列的缺失体重组病毒，真核表达缺失体蛋白，根据ENHANCIN对缺失体的酶解情况，确定靶标蛋白上与酶解作用相关的功能片段。进一步将功能区内的关键氨基酸点突变，真核系统表达突变体蛋白，通过酶解实验确定功能区内的关键氨基酸位点。研究结果将有助于阐明ENHANCIN发挥增效作用的机制，能为开发害虫防治新靶标和新策略提供理论依据。

结论摘要：

本项目以棉铃虫围食膜蛋白为作用对象，拟通过比较增效蛋白ENHANCIN处理和非处理组围食膜蛋白的2D电泳找出差异蛋白点，采用串联质谱、N-末端测序、RT-PCR和RACE等技术克隆差异蛋白点的cDNA，进行序列测定及生物信息学分析，确定棉铃虫围食膜上ENHANCIN相关的靶标蛋白谱及其序列特征。目前已经完成了酶蛋白ENHANCIN的原核表达和真核表达，并对原核表达产物进行了多种方法的纯化研究。生物测定实验证明纯化产物具有增强病毒感染的功能，体外酶解实验后的SDS-PAGE也证明纯化产物能有效降解围食膜上的大分子蛋白，目前正在开展这些差异蛋白的鉴定工作。为了直观的观察目的蛋白在昆虫细胞中的表达情况，本研究成功构建了拥有GFP标签蛋白的重组病毒表达载体，细胞转染结果显示明显绿色荧光，结合SDS-PAGE结果，证明外源蛋白在昆虫细胞中成功表达。本项目还对棉铃虫已知的4种IIM（IIM3，IIM4，IIM86和Mucin）进行了RT-PCR扩增，并对其中的两种蛋白（IIM86和Mucin）进行了原核表达和纯化研究，其中成功表达并纯化了Mucin。构建了IIM3，IIM4和IIM86的重组杆状病毒表达载体，成功表达了IIM86。上述蛋白的表达和纯化为开展体外酶解实验和靶标蛋白的鉴定奠定了基础。另一方面，随着小菜蛾等昆虫基因组注释的完成，本研究还开展了棉铃虫和甜菜夜蛾围食膜蛋白质组的鉴定工作，目前正在进行结果分析。这些围食膜蛋白质的鉴定结果，将有助于进一步明确围食膜的功能以及发现新的ENHANCIN等杀虫相关蛋白的靶标。