中文摘要：

乏氧是肿瘤普遍的生长微环境。肿瘤细胞通过自身相关基因的调控，使细胞适应乏氧环境，对其基因调控机制及功能的研究，有助于发现新的治疗靶点。Kit配基（KL）是重要的生长因子，参与众多生理、病理过程的调控。本研究的前期工作发现肝癌细胞在乏氧状态下出现 HIF和KL的同步表达上调，且后者的启动子活性增加，同时在启动子区可见低氧反应元件 HRE。结合最近的文献报道，我们推测 KL 可能参与乏氧状态肝癌细胞功能的调控。因此，本研究拟检测乏氧状态下HIF-1/HIF-2与KL 的调控关系；采用 ChIP、双荧光素酶活性分析等，阐明 HIF-1/HIF-2 与 KL 的相互作用形式以及 HIF-1/HIF-2 参与 KL 基因转录调控机制；探讨 PI3K-Akt-HIF 通路在调控 KL 表达中的作用；最后观察 KL 对肝癌细胞生长和血管新生的自分泌和旁分泌作用，并分析KL在肝癌患者中的临床病理学意义。

结论摘要：

通过本项目的研究我们探讨了乏氧状态下肝癌细胞中HIF-2 调节 SCF表达的分子机制研究，以肝细胞肝癌细胞系SMMC-7721为研究对象，研究了肝癌细胞乏氧环境下HIF-2 调节 SCF表达的分子机制。为了进一步证明了HIF-2不仅可以直接结合于SCF的基因启动子区，而且能够调节SCF的表达，我们将HIF-2α过表达载体（pF1K-HIF-2α）或者空载体（pF1KOF）和SCF基因启动子区的荧光素酶表达载体（pGL3-SCF: -2185/+184）或SCF基因启动子HRE区突变的荧光素酶表达载体（pGL3-SCFM: -2185/+184）共转染入SMMC-7721细胞，分析过表达HIF-2对启动子转录活性的影响。我们还应用RT-PCR和流式细胞仪检测SMMC-7721，发现其表达SCF受体c-kit，这说明在肝癌细胞中可能存在SCF/c-kit自分泌途径。我们应用100ng/ml的SCF蛋白，施加外源刺激，检测SMMC-7721的增殖水平。如图，SCF对 SMMC-7721有明显的促增殖作用。我们进一步研究提示，应用SCF的中和抗体，施加于乏氧环境下SMMC-7721的培养液中，可以抑制其增殖作用，提示在乏氧状态下，SCF/c-kit自分泌环路在SMMC-7721细胞增殖中起重要作用。为了观察乏氧状态下SCF对HUVEC的迁移作用，我们利用7721细胞乏氧条件下的细胞培养基培养HUVEC细胞，观察划痕修复情况。利用乏氧条件下的7721培养基可以促进HUVEC细胞的迁移，而对照组添加了SCF的中和抗体，可以明显抑制这种迁移作用。临床病理资料分析结果也支持SCF/c-kit在SMMC-7721细胞当中的促增殖作用，以适应特别是乏氧状态下的恶劣生存环境。我们的研究亦表明，在乏氧状态下，肝癌细胞分泌的SCF有助于促进血管内皮细胞的迁移、管状形成。上述研究证实SCF是促进肝癌增殖和血管新生的重要细胞因子；乏氧环境下HIF-2是调节SCF表达的关键转录因子；通过干预HIF-2和SCF信号通路，有可能成为治疗肝癌的潜在靶点。取得成果主要以发表论文和培养研究生的形式体现通过本项目的研究发表SCI论文4篇，培养硕士研究生2名。