中文摘要：

脊髓损伤致残率极高，是一种后果极其严重的损伤。活性氧和线粒体在脊髓损伤后的细胞凋亡发生发展中起重要作用，但通过何种信号途径调控细胞凋亡的，目前尚不清楚。本课题拟通过体外实验和动物实验中观察氧化应激对神经元细胞和伤段脊髓及活性氧-JNK-线粒体信号途径中相关指标（如跨膜电位、Cyt-C、线粒体呼吸功能）和蛋白表达（ASK1、pASK1、JNK、pASK1、JNK、pJNK、Bim、Bcl-2、Caspase9/3）的影响，同时观察JNK 特异性抑制剂SP600125、MPTP 特异性开放剂苍术苷和MPTP 特异性保护剂依达拉奉对该途径的影响，来探讨和验证活性氧-JNK-线粒体信号途径的存在。一旦证实，理论上提出了脊髓损伤中的活性氧-JNK-线粒体信号途径，为脊髓损伤中神经元细胞凋亡方面的研究开辟全新视角。在临床上根据该信号转导途径，早期采用药物阻断这些已经或正在启动的凋亡信号，减轻神经元细胞

结论摘要：

本项目通过应用H2O2及谷氨酸盐刺激模型，以氧自由基清除剂依达拉奉为靶点，对线粒体及内质网应激途径介导的神经细胞凋亡机制进行了深入研究。首先，我们研究了大鼠脊髓损伤后线粒体代谢功能和还原型谷胱甘肽水平的变化，结果表明脊髓损伤后伤段脊髓线粒体内膜底物通透性、呼吸链及ATP／ADP移位体等明显受到影响，线粒体内膜通透性增加，线粒体Ca2+、Mg2+-ATP酶活性降低，加重线粒体内Ca2+超载并导致GSH表达水平持续降低，最终触发一系列病理反应(包括自由基反应)导致线粒体功能障碍，抑制氧化磷酸化反应，形成恶性循环。本研究明确了损伤后12h为挽救线粒体功能的“黄金期”，为在脊髓受伤早期予以相关药物保护线粒体功能、减少神经细胞凋亡，提供了佐证。随后，我们研究了H2O2应激下，MAPK-线粒体途径介导神经细胞凋亡的作用机制。结果表明在H2O2刺激下，p-JNK水平增高，BAD去磷酸化激活，BAD/14-3-3二聚体解离增多；同时BAX选择性地向线粒体移位，打开MPTP，向胞浆大量释放细胞色素C。提前应用依达拉奉，不仅可保护MPTP，减少细胞色素C释放，还可降低BAD与14-3-3的解离，抑制BAX选择性地向线粒体移位。鉴于线粒体途径与内质网应激之间的协同作用，我们进一步研究了PERK/EIF2α/ATF4介导的应激反应在神经细胞凋亡中的作用机制。电镜结果显示单纯谷氨酸盐刺激的神经细胞，其内质网多呈肿胀破裂，而依达拉奉保护的神经细胞，其内质网大多呈聚集状，形态完整。蛋白印迹结果表明在谷氨酸盐刺激下，PERK通过胞浆内结构域的自身二聚体和磷酸化而激活，从而磷酸化激活真核翻译起始因子eIF2α(ser51)，使得内质网应激相关蛋白转录活化因子4(ATF4)表达量增高，最终启动未折叠蛋白反应并水解激活caspase-12。同时，免疫荧光结果显示p-eIF2α(ser51)在胞浆中的表达量随着谷氨酸盐刺激时间的延长而增高。提前应用依达拉奉给予保护则可明显降低PERK/EIF2α/ATF4及caspase-12的活性。综上所述，我们以不同的实验方法，从各个角度论证了线粒体在神经细胞凋亡中的作用，丰富了脊髓损伤的理论研究，为临床治疗提供了重要的分子生物学基础。课题相关研究成果以发表论文为主要衡量指标，共资助发表论文1篇SCI论文(还有1篇在投)、3篇中华级期刊论文、2篇核心期刊论文。