中文摘要：

DENND1B基因是2010年1月新发现的哮喘易感基因，迄今对DENND1B的功能及其与哮喘的关系仍知之甚少。文献报道在神经元细胞上DENND1B是TNF-a I型受体的结合蛋白，负调控TNF-a信号通路。我们的预实验结果显示在两种支气管上皮细胞系上，在TNF-a刺激炎性细胞因子显著分泌的同时，DENND1B表达均明显增加，其机制是否也通过负调控TNF-a信号通路而起作用值得我们进一步探讨。为验证这一作用机制，我们将通过体外细胞模型和体内动物模型，采用RNA干扰和基因转染过表达等手段，拟从分子、细胞、组织以及动物整体水平多方面研究DENND1B在支气管哮喘炎性发病机制中的重要作用，明确DENND1B对TNF-a诱导炎性细胞因子分泌释放的调节机制。本研究将从DENND1B这个新视点为揭示支气管哮喘的发生机制奠定基础，为支气管哮喘的防治提供新的思路。

结论摘要：

为探讨新哮喘易感基因DENND1B参与哮喘的可能机制，本课题在体外研究方面，选择了人永生化支气管上皮细胞16HBE、肺腺癌细胞A549和小鼠树突状细胞肉瘤细胞DCs为细胞模型，首先观察了在不同时间不同浓度的TNF-a对上述三种细胞的炎性因子促释放效应，并选择了适宜的TNF-a刺激强度；其次利用RNA干扰技术对三种细胞DENND1B基因进行敲减后发现，在16HBE和A549细胞上，DENND1B基因敲减可显著增强TNF-a对炎性因子IL-6和IL-8的促释放作用；但在DCs细胞上，DENND1B基因敲减仅显著增加mIL-6的释放，推测DENND1B可能在不同种属和不同类型的细胞上，发挥着不尽相同的功能。然后通过构建DENND1B慢病毒表达载体，我们对16HBE细胞和16HBE DENND1B基因敲减细胞进行了DENND1B基因过表达，结果显示，与正常16HEB细胞比较，DENND1B过表达对TNF-a促IL-6和IL-8释放作用未产生显著影响。与此同时，对于16HBE DENND1B基因敲减细胞进行DENND1B 过表达rescue后，尽管可以部分抑制TNF-a的促IL-6和IL-8释放作用，但与对照组比较，IL-6和IL-8的释放仍显著增加。在体内研究方面，本课题首先建立了小鼠哮喘模型，并观察了体内DENND1B基因转染对哮喘小鼠肺组织中炎性因子水平和肺组织受损程度的影响。结果表明，哮喘小鼠血浆IgE水平显著增高，肺泡灌洗液中白细胞总数、嗜酸性粒细胞百分比、炎性因子TNF-a, IL-4、IL-5、IL-6、IL-10均显著增高，DENND1B基因转染组小鼠与正常对照组小鼠比较，虽然也表现为这些炎性因子显著增高，但与空载体转染对照组比较，肺泡灌洗液中的IL-4水平出现显著下降。肺组织病理学结果显示，哮喘模型组小鼠的支气管管壁增厚，可见黏液栓，肺组织内有大量炎性细胞浸润。DENND1B转染组小鼠的支气管管壁也出现略微增厚，也有中等程度的炎性细胞浸润，但受损程度明显轻于哮喘模型组，支气管管腔黏液栓明显减少。总之，在哮喘小鼠模型上，DENND1B的过表达能够降低肺泡灌洗液中炎性因子IL-4水平，可能是其缓解肺组织受损的重要原因，其进一步的机制将有待深入研究。