中文摘要：

申请人前期研究发现神经干细胞标志物nestin在血管肉瘤,黑色素瘤，非小细胞肺癌中高表达,与恶性度正相关,但其生物学意义不明；进一步以人和小鼠黑色素瘤细胞UACC903,B16为模型RNA干扰nestin表达发现细胞增殖减慢，凋亡增加,G1-S期转化阻滞，提示nestin可能参与了肿瘤的增殖和凋亡;本项目拟进一步用RNA干扰，IP，WB等技术,深入探讨nestin对体内外黑色素瘤模型增殖和凋亡的影响，重点探讨nestin通过激活CDK5及相关通路CDK5-Rb,CDK5-p53-p21-Rb调控细胞周期阻滞G1-S期转化致使增殖减慢，凋亡增加的机制,旨在阐明nestin对体内外黑色素瘤增殖,凋亡的作用及通过CDK5和相关通路调控细胞周期的分子机制,为确立nestin作为肿瘤治疗新靶点提供更充分的科学依据,为巢蛋白在其他高表达nestin肿瘤中的功能研究奠定理论基础。

结论摘要：

本项目延续时间自2010年起至2012年12月共三年，通过利用siRNA技术和构建以慢病毒作为载体的长期干扰质粒体内外干扰黑色素瘤UACC903,B16细胞Nestin表达观察其对细胞增殖，细胞周期和凋亡的影响。结果发现nestin下调可能通过Akt-GSK-3β-cyclin D-Rb蛋白通路调控细胞周期，引起细胞周期G1-S期发生阻滞来抑制细胞增殖，但是并不影响细胞的凋亡（在短期干扰48小时中，发现短暂的细胞凋亡增加现象，之后考虑是这种凋亡被代偿）在体内动物试验中，发现nestin下调使在体肿瘤瘤体缩小，细胞增殖减慢，为nestin作为人黑色素瘤药物治疗新靶点提供理论依据。我们同时用慢病毒和逆转录病毒携带nestin干扰序列感染细胞做此试验，均发现同样的现象。我们在研究增殖的同时做了细胞迁移的检测，发现nestin下调使细胞迁移减慢，细胞形态发生了间质细胞上皮化的改变，相关粘附分子也发生MET现象N-cadherin和b-catenin 在nestin下调的黑色素瘤细胞UACC903细胞膜表达明显下降，细胞形态由梭型变成了上皮样的扁圆形。为进一步探索nestin对黑色素瘤转移的调控提供试验基础。我们同时用慢病毒和逆转录病毒携带nestin干扰序列感染细胞做此试验，均发现同样的现象。短期干扰小鼠黑色素瘤B16细胞nestin表达发现对细胞增殖和迁移均没有影响，而用10mM (+)-Sodium L-ascorbate对其促凋亡发现短期nestin下调B16细胞易于凋亡。长期干扰小鼠黑色素瘤B16细胞nestin表达使单细胞倍增时间明显延长。 至此，我们已经完成了基金报告中90%左右的内容，关于CDK5相关机制的探讨，最后被试验证实在干扰组和对照组之间，CDK5表达没有显著性改变，最后发现是Akt通路，所以改做Akt通路了。关于vimentin与nestin的相互作用的一点内容，因为缺乏相关动态荧光标记物和细胞增殖周期的各种标记，所以没有实施，除此之外的内容全部告以结束.另外增加了基金报告中没有涉及的内容有关nestin对黑色素瘤细胞迁移的影响及部分机制。有三篇第一作者的中文核心期刊全部见刊，还有2篇第二作者的核心期刊，第四作者的SCI文章已经刊出。自己还有3篇SCI文章正在投递。