中文摘要：

KCNE2是几种钾通道β亚基，也是心脏钾通道功能一个重要的调控亚基。我们前期研究发现高龄SHR大鼠心室肌中KCNE2第98位氨基酸发生了磷酸化修饰；且磷酸化的KCNE2导致心脏电生理功能异常。本项目将通过下列几方面研究（1）利用免疫共沉淀技术，查找高龄SHR大鼠心室肌中使KCNE2蛋白发生磷酸化修饰的激酶（2）应用消减抑制杂交法,构建高龄/幼龄SHR大鼠心室肌细胞差减cDNA文库；利用新型分裂泛素化酵母双杂交筛选参与KCNE2蛋白磷酸化过程的辅助性蛋白质（3）利用RNA干扰技术抑制辅助性蛋白质在SHR动物模型中的表达，进一步探究该蛋白的不表达对SHR大鼠异常的心脏功能是否有调好作用。从而一方面从分子水平上对高龄SHR大鼠心室肌中KCNE2蛋白发生磷酸化修饰的机理作进一步的探究；另一方面为室性心律不齐疾病的临床诊断和基因治疗提供科学依据和药理学上的靶位点。

结论摘要：

为了求证我们的假设在高龄SHR大鼠心室肌细胞中，心脏处于高血压和心肌细胞衰老这种生理状况，诱导出了某些蛋白质的表达，而其中有一个或多个蛋白质参与了KCNE2蛋白质磷酸化异常的过程，从而导致大鼠心脏正常生理功能的损伤。为此本项目我们主要通过（1）分离培养幼龄和高龄SHR和WKY(对照)心肌细胞，并分别提取它们的 mRNA，以RT-PCR方法扩增各细胞的cDNA;再利用消减抑制方法成功地构建了幼龄/高龄SHR大鼠差减cDNA文库即通过蓝白斑筛选，获取高龄/幼龄SHR大鼠心肌组织正向消减文库的阳性克隆，随机选择部分阳性克隆，提取质粒，酶切鉴定，发现插入片段的大小主要集中在200-1000bp之间；且长度并不均一,说明我们所构建的文库具有一定复杂性。将上述阳性质粒随机送出测序，将测序结果与GenBank数据库中cDNA和EST序列进行相似性比对，获得差异性表达的cDNA文库。（2）通过一系列含KCNE2诱饵载体构建、分裂泛素化的酵母双杂交实验、 阳性克隆的转化、序列测定和BLAST 比对，发现两种不同的蛋白编码序列，它们分别编码K1和K2蛋白,其中K1是SHR大鼠心肌的一个功能已知的膜结合蛋白；K2为未知功能的蛋白序列。为了进一步探究K1和K2蛋白质在KCNE2磷酸化异常中的直接的功能，我们采用两种方法对它们功能做进一步研究（1）用RT-PCR方法，扩增编码这两种蛋白的基因全长序列，构建过表达载体，通过相关细胞系和动物模型，研究其功能。目前这些实验正在进行之中。（2）用RNA干扰技术，沉默这两种基因的表达，目前这个研究工作已经取得阶段性的实验结果分别构建了入门载体pENTR 1A－k1-siRNA, pENTR 1A－k2-siRNA和两种腺病毒表达载体pAd /CMV /V5－DEST－k1-siRNA 及pAd /CMV /V5－DEST－k1-siRNA，并通过293A细胞将含目的基因的病毒包装成功, 并已经完成了第一代病毒滴度测定工作。目前正在进行病毒的扩增，滴度的测定和纯化工作，后续打算用相关的细胞系和动物模型研究其相关的功能。对本项目获得实验数据的处理(1)一部分的数据正在整理和分析，准备通过发文章和申报专利的方式展示功果；（2）另一部分实验数据，需要做进一步实验探究其功能，揭示其在 KCNE2磷酸化异常过程中真正的作用。这部分的工作具有非常