通过体外培养骨髓间充质干细胞(BMSCs),将其用5-溴脱氧尿嘧啶核苷(Brdu)、三氧化二铁分析纯饱和溶液-新鲜胎牛血清等标记技术标记,标记后的BMSCs注射至距离骨缺损处1.0cm的骨膜下,采用形态学、骨痂定量观察及免疫组化与图像分析等方法观察不同浓度麝香酮单体对BMSCs在动物模型体内迁移的影响及其向成骨细胞分化的能力。目的是观察不同浓度麝香酮单体对BMSCs迁移和向成骨细胞方向分化的影响。此外通过免疫组化方法观察损伤部位趋化因子Fractalkine 、SDF-1 、CXCL-8 、MCP-1、SCF和BMSCs 的变化,用原位杂交技术观察趋化因子受体CX3CR1、CXCR4、CXCR1、CCR2、c-kit的变化,旨在了解麝香酮单体对骨髓间充质干细胞迁移的可能作用机制。如果实验发现麝香酮对BMSCs迁移有影响作用,将为中医"引经"理论提供一种研究方法和研究思路。
muscone;Bone defect;BMSCs;migrate;medicinal guiding
背景骨折及骨缺损是骨科常见病。促进骨折愈合、减少骨缺损是骨科研究的一大热点。中医药治疗骨折历史悠久,当前国内外学者运用现代科技手段对中药促进骨折愈合进行深入研究并取得了一系列成果。研究表明中医药在促进骨髓间充质干细胞(BMSCs)迁移方面发挥了重要作用,但目前这方面的研究很少,尤其是将促进BMSCs体内迁移与中医引经理论相联系的研究尚未见报道。方向引经理论是中医学的重要内容,中医认为引药可以引导药物达于病所,正确选用引药将提高疗效。故本实验以引药代表药麝香的有效成分麝香酮为研究对象,观察其对外源性大鼠BMSCs体内迁移的影响,将引经理论与细胞学结合,旨在探索中医引经理论与干细胞迁移学说之间的联系,为其迁移机制提供理论依据,并从现代医学角度进行论证、阐释中医引经理论的实质。主要内容观察不同荧光标记方法对BMSCs的标记效果,确定最佳方法。体外培养BMSCs后进行鉴定。大鼠骨缺损模型成功后回植BMSCs。将模型大鼠按各组剂量给药、取材、切片。通过免疫荧光染色观察骨缺损处阳性细胞数;采用免疫组化观察趋化因子 Fractalkine 、SDF-1 、CXCL-8 、MCP-1、SCF的变化,通过原位杂交观察相应趋化因子受体 CX3CR1、CXCR4、CXCR1、CCR2、c-kit 的变化,进行统计学分析。结果DAPI和BrdU两种荧光标记方法对BMSCs进行标记。通过荧光示踪发现麝香酮能促进BMSCs体内向损伤部位迁移;麝香酮能促进模型大鼠骨缺损处趋化因子 Fractalkine 、SDF-1 、CXCL-8 、MCP-1、SCF及相应受体 CX3CR1、CXCR4、CXCR1、CCR2、c-kit表达,给药各浓度组和空白组比较有统计学差异(P<0.05),以D(4.2mg/100g)浓度组效果最佳。意义麝香酮促进BMSCs体内迁移的机制与其促进相关趋化因子及相应趋化因子受体的表达关系密切,其可能是通过该途径促进BMSCs向骨缺损处迁移,从而发挥引经作用。通过促进细胞趋化因子及其受体的表达可以促进BMSCs向骨缺损处迁移,从而发挥其损伤修复的作用,这与中医引经理论的内涵颇为切合,据此发现趋化因子及其受体促进BMSCs迁移学说与中医引经理论有着内在的相关性,从现代医学角度可以作为中医引经理论的内涵之一,并验证了引经可以引导药物到达病变部位促进机体自我修复的功能。