中文摘要：

石杉碱甲是当前治疗老年痴呆症最有效的药物之一，但其自然资源日益匮乏，而化学合成成本高、活性低、毒副作用大，远远不能满足临床需求。运用生物技术工业化生产天然石杉碱甲是未来发展的主要方向。目前石杉碱甲生物合成途径已成为研究热点，但均以蛇足石杉为材料，研究进展不大。申请者从蛇足石杉体内分离、筛选得到一株产石杉碱甲的内生菌胶孢炭疽菌。以此为材料，通过农杆菌介导转入标记DNA，构建T-DNA插入突变体库。采用HPLC法筛选石杉碱甲代谢突变菌株，选取单拷贝插入突变体菌株，T-DNA插入位点即为石杉碱甲代谢关键酶基因或调控因子。以插入的标记DNA设计引物，通过TAIL-PCR、RACE等技术获得石杉碱甲生物合成关键酶基因，并运用实时荧光定量PCR、RNAi等技术验证获得的基因功能。本研究将为进一步阐明石杉碱甲的生物合成机理提供理论依据，为运用生物技术构造产石杉碱甲的工程菌奠定理论基础。