中文摘要：

溶藻弧菌是我国南方海水养殖重要病原菌，其主要毒力因子为外毒素碱性丝氨酸蛋白酶。该菌中碱性丝氨酸蛋白酶活性受到群体感应系统的调控作用。同时，本课题组前期研究发现，溶藻弧菌毒株中存在两套VI分泌系统（T6SS）编码基因簇（T6SS1和T6SS2），并与该菌对鱼类/细胞的毒性密切相关，并且这两套T6SS控制了胞外碱性丝氨酸蛋白酶活性。本课题以功能性T6SS1为研究对象，考察T6SS在溶藻弧菌中调控碱性丝氨酸蛋白酶合成/分泌的分子机制，包括阐明T6SS在转录、翻译、翻译后及分泌等哪个环节调控碱性丝氨酸蛋白酶，以及其调控规律，描绘碱性丝氨酸蛋白酶的合成/分泌在溶藻弧菌中受该系统及群体感应系统调控的网络图景。揭示T6SS在毒力因子合成/分泌过程中的作用机制将为病原菌致病机制研究开辟一个新的领域，也为将来溶藻弧菌及其它海水养殖病害防治技术的应用开发如病原诊断、疫苗开发和新型抗菌策略研究打下基础。

结论摘要：

病原菌主要依赖多种分泌系统分泌的胞外蛋白的活性来利用养分、侵染宿主和适应环境。第六型分泌系统(T6SS)是一种新发现的、保守的细菌蛋白转运系统，在革兰氏阴性细菌中受到严谨的调控。在溶藻弧菌中存在两套T6SS基因簇(T6SSVA1和T6SSVA2)，可以编码T6SS标志蛋白Hcp、VgrG以及IcmF，还包括丝氨酸-苏氨酸激酶/磷酸酶(PpkA和PppA)。多种与T6SS相关的细菌生理现象已经被报道，但是其内在机制尚不清楚。在本研究中，我们发现T6SS的标志蛋白溶血素共调蛋白(Hcp1)的表达受到严谨的调控。进一步的实验发现，Hcp1的表达具有生长依赖性，在指数期时达到最高。群体感应系统(QS)中的调节子LuxO和LuxR分别正调控和负调控该蛋白的表达。此外，可替换sigma因子RpoN以及由T6SSVA1基因簇中基因编码的增强子结合蛋白VasH也可以调控Hcp1的表达。T6SSVA1中不仅Hcp1基因，其他T6SSVA1中的基因如icmF1、clpV1和vasA1也受到LuxR、RpoN和VasH的负调控。总之，本研究表明在溶藻弧菌中T6SS的表达受到了QS和可替换sigma因子的调控。另一方面，本研究第一次在溶藻弧菌中将T6SS分泌系统、QS以及与3’,5’-环二鸟苷酸(c-di-GMP)相关的多种毒力表型联系起来。两个T6SS基因簇的框内无标记缺失显示，T6SS的突变可以影响细菌的运动性、生物被膜形成、细胞聚集以及外毒素Asp的产生能力。ppkA1和pppA的缺失导致了Hcp1蛋白表达和分泌的显著开/关，标志着这两个基因对于T6SS调控的重要作用。PppA/PpkA1通过控制胞内第二信使c-di-GMP的水平来控制多种表型的变化。更重要的是，我们发现PppA/Ppk1A可以通过控制群体感应调节子LuxR来调控Asp的表达，而在本实验室之前的研究中已经证明了LuxR对Asp的表达有正调控作用。全基因组转录谱分析结果表明，ppkA和pppA缺失株中100多个基因的表达水平受到了显著的影响。以上结果表明，溶藻弧菌中T6SS的PppA/PpkA1介导调控多种表型，丰富了我们对新发现的T6SS系统的认识，为溶藻弧菌及其他海水养殖病害防治技术的应用开发如病原诊断、疫苗开发和新型抗菌策略研究打下基础。