中文摘要：

鲎抗内毒素因子及其模拟肽可直接中和内毒素，显著提高内毒素休克小鼠和急性腹膜炎小鼠的生存率，且具有免疫调节作用，然其相关靶点尚未见报道。课题组前期研究表明模拟肽CLP-19可与单核/巨噬细胞膜直接结合，上调趋化因子、粘附因子的表达，并能抑制IL-1β刺激所介导的炎症因子升高；且具有介导LPS与细胞结合，阻断LPS功能的"灭活载体"特性，提示CLP-19在单核/巨噬细胞胞膜上存在作用靶点。本研究拟通过合成并纯化GST标记的CLP-19，利用pull down技术捕获CLP-19在胞膜上的结合蛋白，2D-PAGE分离蛋白并质谱鉴定；通过蛋白组库比对及筛选候选靶蛋白，构建靶蛋白siRNA，以检测该靶点在CLP-19免疫调节中的作用。最终明确CLP-19在单核/巨噬细胞胞膜上的作用靶点及其机制，为该肽免疫调节和脓毒症预防提供理论依据；并为设计和开发类似肽及其靶向新药奠定基础。

结论摘要：

通过本课题的实施，鉴定了鲎抗内毒素因子及其模拟肽在单核/巨噬细胞的的靶蛋白及信号通路。具体完成情况如下 1. 完成实验所需CLP-19的合成、修饰、结构与活性研究本部分采用Fmoc固相化学合成法制备多肽，所得CLP-19和LL-37的纯度分别为98.4%和99.1%，并以生物素（CLP-19B）和荧光素（CLP-19F）修饰。原二色光谱结果显示CLP-19, CLP-19B和CLP-19F在水溶液和POPC-POPG (1:1)脂质体中二级结构相似。ELISA、磷酸化测定、LAL和细胞毒性实验表明三种多肽在TNF-α释放、NF-κB信号通路、LPS中和和细胞毒性等活性方面没有显著差异 (p>0.05)。 2. CLP-19与RAW 264.7细胞特异性结合蛋白的鉴定和作用特征多肽亲和色谱和质谱分析鉴定CLP-19主要结合蛋白为α/β微管蛋白，该结果被免疫印迹和免疫荧光法所验证。同时我们还证明CLP-19可以和微管蛋白直接、特异性结合，且该结合受盐离子浓度的影响较小。生物信息学计算机模拟分子对接研究还表明CLP-19主要结合在α、β微管异二聚体的凹槽位置。 3.CLP-19与RAW 264.7细胞微管蛋白结合发挥免疫调节作用的机制微管聚集实验表明CLP-19可促进游离微管蛋白组装成微管，该效应不仅增加了微管组装的最大速率和聚合量，也消除了组装的成核阶段。此外，CLP-19还可避免微管因为温度降低所致的解聚。流式细胞仪和免疫荧光分析发现单独CLP-19对细胞表面TLR4的表达没有影响，但预孵育多肽可显著降低LPS所致的表面TLR4高表达。而免疫印迹和免疫荧光检测又表明CLP-19作用的细胞总TLR4表达量与药物空白细胞对照无明显区别。本研究同时还发现CLP-19在预孵育15 h范围内可时间依赖性降低LPS所致的TLR4和TNF-α高表达，表明体外最佳预保护时间为15 h。研究结论 1. α和β微管蛋白为CLP-19在小鼠巨噬细胞RAW264.7中的特异性结合蛋白。 2. CLP-19作用于微管可干扰其动力学平衡，降低微管依赖性TLR4囊泡运输效率。 3. CLP-19可通过降低细胞表面TLR4受体的表达抑制LPS对巨噬细胞的刺激。研究发表论文四篇，其中SCI两篇，核心期刊两篇。