中文摘要：

果蔬采后失绿直接影响产品感官品质和货架寿命，要实现该过程的人工控制，需要深入研究采后叶绿素降解调控机制。在高等植物中叶绿素降解存在PaO 和氧化漂白两条分支途径，两者之间的关系如何，降解主流是否会因环境条件的变化而发生改变是尚未解决的关键问题。芥蓝不仅是我国特色出口蔬菜之一，而且前期研究表明在失绿的芥蓝中存在两条降解途径的产物。为此本项目以芥蓝为对象，选取两条途径中的关键酶即PaO 途径的叶绿素酶和氧化漂白途径的叶绿素氧化酶为靶目标，建立酶活性的高效检测方法；克隆酶基因；考察光照、温度、湿度、CO2、O2、乙烯和保鲜剂成分对上述两种酶活性及基因表达的影响；结合酶促反应产物叶绿酸和C13-羟基叶绿素含量分析，阐明两条途径之间的关系，揭示环境因子对降解主流的影响，进而通过控制贮藏条件达到采后持绿效果。本研究成果期望应用于果蔬采后的色泽控制，并在叶绿素降解的基因表达调控理论上有新的发现。

结论摘要：

果蔬采后失绿直接影响产品感官品质和货架寿命，要实现该过程的人工控制，需要深入研究采后叶绿素降解调控机制。在高等植物中叶绿素降解存在脱镁叶绿酸氧化酶（PaO）和氧化漂白两条分支途径，两者之间的关系如何，降解主流是否会因环境条件的变化而发生改变是尚未解决的关键问题。为此本项目以我国特色出口蔬菜芥蓝为对象，对两条途径中的关键酶进行了分离纯化、基因克隆；不同生长阶段、贮存条件及植物生长调节剂对关键酶基因表达和酶活性的影响；叶绿素降解及酶促反应产物分析；以及保鲜方式、关键酶表达和持绿效果之间的内在联系。取得的成果包括1）叶绿素酶和过氧化物酶分离纯化方法的改良。经典的植物叶绿素酶的分离纯化方法，过程复杂，酶收率低；而过氧化物酶多以同功酶形式存在，在体外的半衰期短，分离过程中容易失活。本课题简化了二者纯化方法，在保持酶活性的同时，达到了纯度要求。2)关键酶基因克隆与表达。克隆了脱镁叶绿素酶和两种过氧化物酶基因，与NCBI公布的同类基因比对结果表明，保守区域同源性分别在99%、98%和92% ，将编码区基因插入pET-28a，转化E. coli BL21，诱导表达，Ni2+亲和纯化，获得了重组蛋白。3)环境因子对关键酶基因表达及降解主流的影响。植物在不同的生理阶段、不同的胁迫条件都有可能触发叶绿素的降解。本课题选择了在活体/离体、幼苗期/成熟期、以及促衰/持绿胁迫对叶绿素降解途径关键酶表达的影响。根据已克隆关键酶基因，设计引物，以actin 为参照，进行RT-qPCR、凝胶电泳和ImageJ软件分析，并结合酶活性的测定及非变性凝胶电泳酶活性检测。结果表明在采后贮藏的关键因子乙烯和温度胁迫中，乙烯能显著促进叶绿素降解和过氧化物酶的表达水平，而脱镁叶绿素酶基因的表达未见明显改变；低温能抑制叶绿素降解，降解速度与脱镁叶绿素酶基因表达相关联，而过氧化物酶基因未见显著变化。4）短波紫外线（UV-C）辐照持绿方法的开发。UV-C辐照作为一种安全、无污染的绿色环保保鲜方式，近年来受到广泛关注。本项目的研究结果表明UV-C辐照处理抑制了贮藏前期脱镁叶绿素酶活性的快速增加，从而减缓了叶绿素的降解速度。以上结果期望在叶菜采后叶绿素降解基因调控理论和色泽控制的应用上有所借鉴。