中文摘要：

本项目以慢病毒敲降Cyp26a1小鼠模型、基因疫苗免疫和RNAi等为技术平台，在前一个已结题项目研究工作基础上，从细胞和分子水平研究阻断Cyp26a1特异表达显著降低胚胎着床率的分子机制。基因芯片等高通量方法筛选RA敏感基因，探寻直接影响植入的关键分子及Cyp26a1对关键分子的调节机制；确证胚胎着床过程中Cyp26a1的作用是否由RA信号通路介导。通过敲降小鼠模型等，采用SSH、生物芯片高通量检测等技术，筛选与Cyp26a1表达相关的差异基因，利用沉默目的基因技术探究基因的功能和相关的调控因子。Pull-down或蛋白质功能芯片等技术研究与Cyp26a1相互作用的蛋白，探寻和发现Cyp26a1调节胚胎植入作用的信号通路（非RA介导）。以期深入了解Cyp26a1参与着床过程的作用及免疫抗着床的分子机理，为发展拥有自主知识产权人类控制新型避孕手段和不育症的诊治提供新方法和新技术。

结论摘要：

在前一个已结题项目研究工作基础上，本项目以寡核苷酸MO敲降Cyp26a1小鼠模型、基因疫苗免疫和RNAi等为技术平台，从细胞和分子水平研究阻断Cyp26a1特异表达显著降低胚胎着床率的分子机制。基因芯片等高通量方法筛选RA敏感基因，探寻直接影响植入的关键分子及Cyp26a1对关键分子的调节机制。利用Cyp26A1基因疫苗免疫小鼠为模型研究Cyp26A1的下游作用靶细胞及确定Cyp26A1对靶细胞的作用是否存在视黄酸（RA）依赖性。流式细胞术检测结果显示，疫苗免疫小鼠外周血和脾脏中CD4+RORγt+ Th17细胞比率明显上升。检测疫苗免疫小鼠子宫组织，植入位点周围RORγt和IL-17蛋白水平显著降低。采用Cyp26A1抗体阻断模型和Cyp26A1慢病毒干扰模型进一步确认Cyp26A1对Th17细胞的调节作用。流式细胞术检测结果显示抗体阻断和慢病毒干扰均能增加外周血和脾脏中CD4+RORγt+ Th17细胞比率。疫苗免疫小鼠子宫组织发现抗体阻断和慢病毒干扰均降低植入位点周围RORγt和IL-17的表达。利用高效液相色谱（HPLC）检测疫苗免疫小鼠子宫中的RA含量，发现植入的关键时间妊娠D5天子宫中at-RA水平上升。子宫中的RA受体RARα也显著增加。用RARα特异的激动剂和抑制剂处理小鼠，WB检测RORγt和RARα的表达，进一步证明RARα在Cyp26A1的调节作用中发挥着信号传递分子的作用。研究发现Cyp26a1在胚胎植入过程中的作用，部分是通过RARα通路调节TH17细胞实现的。提出了Cyp26A1调节围植入期Th17细胞的可能通路抑制Cyp26A1可使子宫中的RA含量上升，通过RARα传递至Foxp3，导致子宫中Th17细胞减少及IL-17分泌量下降，从而使子宫免疫耐受微环境受到影响。我们选取妊娠的ICR小鼠，在D4腹腔注射外源RA，分别在D5、D6、D7、D11观察胚胎植入数，实验结果处理组与对照组胚胎植入数无明显差异。提示，外源RA对胚胎植入无明显影响，为此我们采用MO敲降Cyp26A1，进行转录组测序，试图寻找受Cyp26A1调控的新的信号分子。探寻和发现Cyp26a1调节胚胎植入作用的信号通路，深入了解Cyp26A1参与着床过程的作用的分子机理，为发展拥有自主知识产权的人类新型避孕手段和不育症的诊治提供新方法和和新技术。