中文摘要：

视网膜退行性疾病包括视网膜色素变性、年龄相关性黄斑变性等，严重威胁人类视力健康，但目前在临床上仍无长期有效的防治办法。近年来，有实验室将对光照反应敏感的外源性光感受蛋白基因转导入退变视网膜的剩余神经元中，使其直接对光照产生反应，从而恢复视网膜退变动物模型的视觉。这种利用光感受蛋白的新兴基因治疗概念，应用前景诱人。但是目前研究在光感受蛋白和下级靶神经元的选择上仍有明显不足。因此，本研究将选择不同的特异性靶细胞和光感受蛋白来优化视网膜退变动物模型的治疗效果。由于内源性光感受蛋白对光反应敏感且无免疫负效应，我们将探索定向基因转导内源性光感受蛋白黑视素（melanopsin）或视紫质（rhodopsin）进入给光型双极细胞后，视网膜退变小鼠模型中视网膜神经元的光反应以及整体视觉行为的改变。此项研究将为恢复视网膜退变患者的视觉提供重要的临床理论基础。

结论摘要：

本课题计划通过基因转染内源性光感受蛋白（黑视素及视紫质）进入视网膜给光双极细胞中，达到恢复视网膜退变小鼠视觉的目的，从而为临床治疗视网膜退行性疾病开辟新途径。我们首先构建了含黑视素、视紫质基因编码区的质粒Grm6-Opn4-GFP和Grm6-Rho-GFP (其中Grm6为给光双极细胞特异受体mGluR6的启动子，Opn4和Rho分别为黑视素和视紫质基因编码区，GFP为绿色荧光蛋白基因)，并通过在体电穿孔技术将黑视素和视紫质特异性转导入给光双极细胞并成功表达。视网膜电位记录显示被黑视素转染的视网膜退变小鼠部分恢复了b波，提示给光双极细胞群体恢复了一定的光反应。黑白箱实验表明黑视素治疗组在黑箱的停留时间有所延长，表现出了明显的趋暗特性，提示动物的视觉行为有所恢复。但视动实验显示黑视素治疗组对于不同空间频率的光栅辨别能力未见明显提高。我们进一步开展了电生理实验测试转染黑视素的给光双极细胞及下游节细胞的光反应。目前为止，全细胞箝记录被黑视素转染的给光双极细胞尚未记录到明显光反应。但通过多电极阵列记录系统，我们在被黑视素转染的rd1小鼠视网膜中成功记录到了节细胞的光反应，这种光反应发放缓慢而持久，类似于含有黑视素的内源性光敏感节细胞的反应。但其可以被谷氨酸受体阻断剂DNQX和AP5阻断，表明光反应来自上级神经元，而不是内源性光敏感节细胞自身。因此我们实验表明基因转染黑视素进入给光双极细胞可以部分恢复视网膜退变小鼠的视网膜电位、视觉行为以及节细胞的对光反应。另一方面，视紫质基因转染的实验目前尚未发现能够明显提高视网膜退变小鼠的视觉。因此，在黑视素和视紫质两种内源性光敏感蛋白中，黑视素基因在临床治疗视网膜退行性疾病中具有更诱人的应用前景。