中文摘要：

肿瘤细胞端粒酶活性与肿瘤发生以及MDR表型相关。除了维护端粒长度外，研究显示，端粒酶线粒体转位对mtDNA以及线粒体功能有保护作用。我们的研究发现，SK-Hep1/CDDP耐药细胞随着细胞耐药指数的增加，细胞线粒体端粒酶表达也明显增加。推测端粒酶线粒体转位可能是肝癌细胞多药耐药发生的新的机制。本课题首先确立SK-Hep1细胞MDR表型与端粒状态、端粒酶活性/线粒体转位的关系。通过调控端粒酶线粒体转位，观测肿瘤细胞MDR表型及相关基因表达的变化。构建靶向线粒体的正、反义端粒酶真核表达载体，并转染相应细胞，进一步验证线粒体端粒酶转位对多药耐药表型的影响以及MDR相关基因表达的差异。并观测肿瘤细胞转染靶向线粒体表达端粒酶正、反义表达载体对细胞凋亡、线粒体功能、线粒体通透性转换孔道(mPTP)的影响以及对mtDNA损伤的保护作用。阐明端粒酶线粒体转位参与肝癌多药耐药发生的机制。

结论摘要：

肿瘤细胞端粒酶活性与肿瘤发生以及MDR表型相关。除了维护端粒长度外，研究显示，端粒酶线粒体转位对mtDNA以及线粒体功能有保护作用。我们的研究发现，SK-Hep1/CDDP耐药细胞随着细胞耐药指数的增加，细胞线粒体端粒酶表达也明显增加。推测端粒酶线粒体转位可能是肝癌细胞多药耐药发生的新的机制。本研究通过观察线粒体端粒酶表达与肝癌细胞化疗耐药的关系，探讨肝癌细胞多药耐药产生的机制。首先，采用分子克隆技术成功构建了靶向线粒体hTERT过表达慢病毒载体PLE-mito –hTERT；采用DNA测序、激光共聚焦显微镜和Western bot检测hTERT,以验证载体构建的正确性；其次，以慢病毒载体PLE-mito-hTERT转染肝癌细胞系SK-Hep1和HepG2；采用CCK-8试剂盒检测肝癌细胞耐药状态；免疫荧光测定caspase-3的活化状态；TMRE 探针检测线粒体膜电位水平；流式检测凋亡水平；Q-PCR 检测线粒体DNA拷贝数目变化。初步揭示了线粒体hTERT可能通过其增强mtDNA复制水平，增强线粒体功能，抑制线粒体相关凋亡通路激活，参与肝癌细胞化疗药物的耐受机制。 1.成功构建靶向线粒体hTERT过表达慢病毒载体PLE-mito –hTERT，利用该载体成功构建线粒体hTERT过表达SK-Hep1和HepG2细胞模型； 2.线粒体hTERT过表达能增加肝癌细胞对多种化疗药物的耐受性； 3.线粒体hTERT过表达能增强mtDNA复制水平，能减少药物刺激下线粒体膜电位的降低，提高药物应激状态下的线粒体功能； 4.线粒体hTERT过表达能减少药物刺激下Caspase-3的激活，减少药物诱导的细胞凋亡； 5.构建裸鼠荷瘤实验验证，线粒体hTERT过表达能增加人肝癌细胞对化疗药物的耐受性； 6.线粒体hTERT可能通过其增强线粒体功能，抑制线粒体相关凋亡通路激活的作用，参与肝癌细胞化疗药物的耐受机制。结论hTERT线粒体过表达可增加肝癌细胞对化疗药物的耐药性；线粒体hTERT可能通过降低mtDNA损伤水平，保护线粒体功能，抑制线粒体凋亡途径的激活，参与人肝癌细胞获得性多药耐药过程。