中文摘要：

哺乳动物细胞大规模高密度培养过程中二氧化碳的生成和积累，不仅有害于培养环境pH和渗透压的控制，而且也会导致目标产物表达效率的大幅下降，已成为重组蛋白、抗体等生物技术药物高效工业化生产的关键性难题之一。为此，本项目将以表达抗体融合蛋白的CHO细胞为研究对象，研究二氧化碳对其产物表达行为的影响及其机制。通过认识决定培养环境中溶解二氧化碳浓度的关键参数，从细胞生理特征和物质、能量代谢入手考察细胞对溶解二氧化碳积累的生理响应，并进一步从产物表达环节，研究、分析胞外二氧化碳浓度对产物表达行为的调控作用及其机制。在此基础上，寻求解决CHO细胞大规模高密度培养过程中二氧化碳累积导致产物表达效率降低的有效途径和方法，为建立经济高效的重组蛋白、抗体等生物技术药物工业化生产过程以及突破现有产能瓶颈奠定基础。研究结果对于优化其它工程细胞的规模化培养过程、提高产物表达效率也将具有重要的指导意义。

结论摘要：

随着细胞密度提高和规模扩大，培养过程中二氧化碳积累导致的产物表达效率大幅下降已成为限制重组蛋白、抗体等生物技术药物高效工业化生产的关键性难题之一。本项目紧紧围绕动物细胞大规模高密度培养过程中二氧化碳累积所导致的产物表达效率下降这一核心问题，以表达抗体融合蛋白的CHO细胞为研究对象，系统研究大规模无血清高密度流加培养过程中胞外二氧化碳浓度对细胞生理各项指数的影响。首先通过分析不同细胞密度和营养代谢状态下细胞的二氧化碳生成速率，以及环境参数对其生成速率的影响，得到二氧化碳生成与氧消耗速率具有相似变化趋势，在细胞的维持阶段呼吸商相较于生长期偏低且受到环境中温度的影响明显；在不同规模的通气鼓泡式机械搅拌反应器以及自行设计的鼓泡柱中进行了有关流体混合和气液传质实验，通过了解生物反应器操作各参数对流体混合的影响建立了生物反应器内氧和二氧化碳的传质模型CTR=Qm/V？(CO2in-CO2out)，并在200L通气鼓泡式机械搅拌反应器的流加过程中得以验证。通过这些研究，认识影响动物细胞大规模高密度培养过程中溶解二氧化碳去除的关键因素。其次通过研究不同二氧化碳累积实验，了解到胞外二氧化碳分压升高的情况下，在胞外pH不变的情况时，胞内pH不断下降，同时胞内的碳酸氢根不断上升；此外在培养后期，胞外二氧化碳分压的升高会造成线粒体膜电势下降，且在分压升高不明显时，氨的排出受到抑制；较高的胞外分压也可以抑制细胞的生长速率，并且明显促进乳酸的生成，抑制谷氨酰胺的消耗，降低抗体融合蛋白的比生成速率，最终造成产量的下降。最后，通过观察上述的现象，结合胞外分压升高会造成乳酸生成量增多这样一个现象，通过半乳糖和丙酮酸的添加实验得到二氧化碳分压升高的情况下，细胞更依赖糖酵解途径提供能量；通过酮戊二酸的添加实验进一步验证胞外二氧化碳分压的升高会造成线粒体的活性受损，而其原因则是二氧化碳分压的升高会造成胞内异柠檬酸脱氢酶2和3型转录水平的下降；当胞外二氧化碳浓度升高时其胞内的产物的mRNA水平下降，且胞内的脂类前体含量下降，最终导致细胞表达产物的能力下降。综上所述，通过研究和分析胞外二氧化碳累积所导致的细胞生理状态以及物质、能量代谢改变对产物表达的影响，揭示了胞外二氧化碳浓度对动物细胞产物表达行为的调控作用及其机制，为建立经济高效的重组蛋白、抗体等生物技术药物工业化生产过程及突破产能瓶颈奠定基础。