中文摘要：

基因的适应性进化最终决定形态、行为和生理上的适应，以及进化创新。利用比较基因组学和生物信息学方法对功能基因正选择作用的检测和进化分析已成为分子进化的研究趋势。Rubisco活化酶（RCA）是光合作用中调节Rubisco活性的关键酶，它的结构与功能的研究已经成为光合作用研究的热点，但对其基因的适应性进化方面的研究还是一个需要重视的新领域。水生植物是一个特殊的生物类群，在生活型方面表现出多样性和对水生环境的极大适应性，为研究光合作用关键基因的适应性进化提供了很好的材料。本项目拟通过分子生物学手段对具有不同生活型的水生植物代表性物种的RCA基因进行大量克隆测序，然后运用生物信息学工具对RCA基因序列进行数据挖掘，从系统发育关系、功能分歧、正选择位点和蛋白质三级结构四个方面对RCA基因进行研究，为揭示RCA基因适应性进化的分子机制和通过基因工程手段改造RCA基因的功能提供依据和参考资料。

结论摘要：

本研究克隆了具有典型气生叶和沉水叶二态性的水生植物禾叶慈姑两个Rubisco活化酶（RCA）的基因全长序列，并对其表达模式进行了深入研究。对转录本和DNA编码序列比较分析表明禾叶慈姑RCA基因具有两个不同的可变剪接产物（SGrca1和SGrca2），他们分别编码43k和31kDa的RCA蛋白。31kDa的RCA除了缺失110个氨基酸以外与43kDa蛋白完全一致。这两个可变剪接产物的mRNA表达模式分析表明他们均在绿色组织中表达。在14h(昼)/10h(夜)的光周期下，气生叶和沉水叶中SGrca1 和 SGrca2具有相似的表达节奏，但在沉水叶中两个转录本的表达量均显著小于气生叶。免疫印迹分析表明，两种RCA蛋白在两种叶型中都表达，但43kDa亚型比31kDa亚型的蛋白含量明显要高。免疫共沉淀的实验结果表明两种RCA亚型均参与Rubisco的相互作用，但有趣的是沉水叶中31kDa亚型的比例较气生叶中显著升高。由于31kDa的RCA蛋白缺少AAA保守结构域的110个关键氨基酸残基，我们推测它本身不具有Rubisco活化功能，但它在体内可能通过与43kDa的RCA蛋白结合形成低活性的多聚体来实现对沉水环境下的Rubisco活化起到负调节作用。本研究填补了水下光合作用中RCA基因表达研究的空白，为进一步研究水生植物光合作用对沉水环境的适应机理提供了新证据。本研究还克隆了来自12种不同生活型水生植物的RCA编码基因全长序列。通过构建系统发育树，我们分别运用PAML软件中的分支模型、位点模型和分支位点模型对RCA全长基因进行了正选择位点的检测。在沉水植物分枝中的水盾草、穿叶眼子菜和海菜花这三种沉水植物共检测到５个后验概率大于95%的正选择位点（3D，40P，233V，280G和288K）。通过与已知晶体结构的烟草RCA序列对比，沉水植物海菜花中检测到的正选择位点233V与RCA蛋白AAA核心结构域的Loop3结构相比邻，该区域与RCA蛋白的分子伴侣功能密切相关；而在水盾草和海菜花中均检测到的正选择位点288K则位于RCA-RCA结合区附近，该区域与RCA蛋白分子间的相互作用关系密切。这些沉水植物中正选择位点的检出表明RCA蛋白的分子伴侣功能和RCA分子间蛋白相互作用对沉水的光合作用环境可能产生了适应性进化。该结果为了解RCA蛋白对沉水环境适应性进化的分子机制提供了新线索。