中文摘要：

结核分枝杆菌中存在原核类泛素蛋白(Prokaryotic ubiquitin-like protein，Pup)，Pup共价标记多种功能蛋白，并介导被标记蛋白通过蛋白酶体降解，Pup-蛋白酶体系统揭示了一个崭新的原核蛋白降解机制。结核分枝杆菌基因组上存在多个毒素-抗毒素（Toxin-antitoxin,TA）系统，其中的毒素蛋白参与应激条件下的细菌生长抑制，与结核菌的持留相关。毒素蛋白对蛋白酶不敏感，目前对毒素蛋白的降解机理缺乏了解。我们的前期研究发现共表达Pup可以导致毒素蛋白Rv2801c的降解，这种降解作用在营养缺乏时被减弱。毒素蛋白降解是TA系统功能调控的重要环节，本项目中我们将针对多个TA系统，鉴定其中的毒素蛋白是否是Pup的靶蛋白，阐明毒素蛋白降解的分子机理，揭示不同生长条件下Pup-蛋白酶体系统对TA系统功能的动态调控，深入认识Pup-蛋白酶体系统在结核菌生长调控中的作用。

结论摘要：

本项目旨在揭示Pup-蛋白酶体系统对毒素-抗毒素系统的调控，探讨Pup-蛋白酶体系统在应激条件下分枝杆菌生长调控中的作用。我们主要完成了以下4个方面的工作 1. 结核分枝杆菌毒素-抗毒素系统的鉴定 MazEF是细菌基因组上广泛存在的毒素-抗毒素系统。我们的研究表明，在结核分枝杆菌的7个MazF同源蛋白中只有Rv1991c、Rv2801c、Rv1102c和mtPemK是毒素蛋白，且与其上游基因构成毒素-抗毒素系统，其中Rv1991c、Rv2801c和Rv1102c通过切割mRNA发挥毒素蛋白的作用，但mtPemK不具有RNA内切酶的活性，可能通过抑制细菌的胞质分裂来发挥作用。 2. Pup-蛋白酶体系统的研究我们分别构建了Pup、PafA、Dop或蛋白酶体？亚基敲除的分枝杆菌菌株；表达纯化Pup、Dop和PafA等蛋白，构建了蛋白Pup化体外鉴定体系；在大肠杆菌中共表达PafA和PupE，构建了蛋白Pup化体内鉴定系统；发现PafA可以通过催化自身的多Pup化进行Pup-蛋白酶体系统的自我调控。 3. Pup-蛋白酶体系统对毒素-抗毒素系统的作用我们的研究表明，耻垢分枝杆菌MSMEG_5635/MSMEG_5634系统中的抗毒素蛋白MSMEG_5635能被单Pup化，K6、K17或K24都可以是Pup化修饰位点。结核分枝杆菌Rv1991a-1991c和Rv1103c-1102c系统中的毒素和抗毒素蛋白均不能被Pup化；mtPemI-mtPemK系统中的毒素蛋白mtPemK可以被单Pup化，Pup化位点在K16或K64；Rv2801a-2801c系统中的抗毒素蛋白Rv2801a能被单Pup化，Pup化位点在K2，但毒素蛋白Rv2801c可以在多个位点被Pup化，而且共表达Pup可以显著降低Rv2801c毒素蛋白对分枝杆菌的生长抑制作用。 4. Pup-蛋白酶体系统在应激条件下的分枝杆菌生长调控中的作用我们的研究发现:1）在对数生长期耻垢分枝杆菌中蛋白的Pup化水平较低，进入静止期时显著升高；2）负责清除过氧化氢的关键酶KatG、SodA和AhpC均可被Pup化，敲除Pup-蛋白酶体系统相关基因能增强耻垢分枝杆菌对过氧化氢的耐受能力；3）敲除Pup-蛋白酶体系统相关基因导致耻垢分枝杆菌对热激敏感。这些结果表明Pup-蛋白酶体系统参与应激条件下的分枝杆菌生长调控。