生物大分子之间的相互关联,包括构象变化、相互识别、相互作用等是生命活动的重要基础。因为这些相互作用不仅控制着基因转录、细胞分裂和细胞增殖,同时还介导细胞的信号转导、致癌转化等过程。如果能够在生理环境下实时动态观测生物大分子在活细胞中的行为,对于深入了解生物大分子在实际生活环境下的功能和作用极其重要。这是解释许多生命现象的关键。荧光共振能量转移(FRET)是研究活细胞中生物大分子相互作用的有效方法。但是,在活细胞FRET研究中,由于研究对象非常复杂,并且信号太弱、细胞自发荧光干扰强,还要保持细胞的活性,因此对探测技术的要求很高。本课题拟将飞秒激光技术、双光子激发荧光方法和光学图像处理方法应用于生命科学领域,发展活细胞内、原位、实时的四维(空间三维、时间一维)可视化新方法,拟实现高灵敏、高分辨、动态观测活细胞内生物大分子的运动、变化和相互作用,为从分子层次上研究活细胞内的生命现象提供新手段。
本课题将飞秒激光技术、显微荧光成像技术、原子力显微镜和图像处理方法等应用于活细胞研究,实现了活细胞的原位、实时的四维可视化观测,取得的主要成果有(1)搭建了适于活细胞的双通道荧光快速显微成像装置,实现了用一个ICCD同时进行两道荧光成像。该系统成像速度和灵敏度很高,已实时观测到水溶液中量子点为供体的FRET现象。进一步采用Z-Motor纵向扫描,以及二维去卷积和三维重构,实现了活细胞的三维立体成像。我们将该系统应用于GSNO启动小鼠胸腺细胞凋亡开关过程的实时动态观测,利用Annexin V-FITC标记早期凋亡细胞膜上PS翻转,实时记录了单个活细胞在GSNO诱导下的凋亡过程及其凋亡启动时间点;实时记录了GSNO和SRS对胸腺细胞凋亡的协同调节作用过程。(2)利用飞秒激光,建立了活细胞双光子荧光四维实时可视化观测方法,对小鼠受精卵细胞进行了实时观测,为大、厚细胞的实时观测提供了新手段。(3)利用原子力显微镜建立了大鼠神经元的超微结构的成像方法,观察了神经突起受损后的自我修复过程,及老年痴呆症致病因素之一的Aβ蛋白对于神经元生长锥的毒性作用。为进一步研究提供了有意义的信息和研究方法。