根据已纯化获得的49kDa及110kDa两个稻瘟菌糖蛋白激发子的N端氨基酸序列和质谱的结果,采用RT-PCR及RACE等技术克隆其基因,选择特异、高效的真核表达系统进行转化、鉴定,验证是否是无毒基因编码稻瘟菌激发子糖蛋白。用两相分配法制备水稻幼叶中的微粒体膜,用14C标记激发子,经ELISA法或放射结合法检测结合到微粒体膜上的激发子,确定受体结合位点。以激发子处理水稻后诱导抗性相关酶活及植保素的变化确定受体生理功能,并进行受体的纯化及分子组成研究。结果可为揭示寄主水稻与病原菌稻瘟菌之间的相互识别及专化性形成机制等提供重要依据,并为进行转"双元件"基因水稻抗病品种提供材料。
根据已纯化稻瘟病菌糖蛋白激发子CSBI和MG49的N端氨基酸序列和质谱分析结果,克隆了两个激发子的cDNA序列,并通过NCBI数据库对这些序列进行了比对。构建了CSBⅠ、MG49激发子推导编码序列的真核表达载体,并在毕赤酵母(Pichia pastoris)中进行甲醇诱导表达,获得了高效表达的MG49稻瘟菌激发子糖蛋白。利用匀浆-差速离心法、水双相分配法,分离纯化了纯度较高、封闭性好的水稻叶片细胞质膜。将激发子转PVDF膜,分别与地高辛标记的粗膜、质膜进行亲和印迹,结果表明粗膜与质膜均可与MG49糖蛋白激发子产生结合信号。将粗膜和质膜转PVDF膜,与地高辛标记的激发子进行亲和印迹,结果表明粗膜与质膜均可与MG49糖蛋白激发子产生同一的结合信号,表明在水稻叶片质膜上存在稻瘟菌MG49糖蛋白激发子的结合蛋白。将质膜上的结合蛋白进行质谱分析鉴定,用SEQUEST进行数据处理,再经NCBI Oryza sativa 蛋白数据库检索,鉴定结合蛋白为unname protein product CAA34004.1蛋白。对CAA34004.1的分析表明,结合蛋白具有受体的特征。