中文摘要：

申请者前期研究发现，特发性血小板减少性紫癜（ITP）患者外周血CD4+CD25- T细胞能够诱导生成血小板糖蛋白（GP）特异性CD4+CD25+ 调节性T细胞（iTreg），该iTreg通过Notch信号通路（DLL1、JAG2和Notch1分子）和TGF-β1信号通路（TGFBR3、SKIL和 TAB1分子）诱导树突状细胞（DC）产生致耐受性，进而诱导其他GP反应性T细胞免疫耐受。本课题拟在此基础上对ITP中GP特异性iTreg诱导致耐受性DC分化相关Notch和TGF-β1信号通路及其分子进行功能鉴定，研究特异性封闭或上调DC中DLL1、JAG2和Notch1以及TGFBR3、SKIL和 TAB1基因表达后对DC产生抗原特异性免疫耐受效应的影响，从正反两方面验证其调控DC分化的作用，揭示抗原特异性iTreg诱导DC产生致耐受性的机制，为ITP等自身免疫性疾病的的免疫干预提供新靶点。

结论摘要：

我们首先建立了具有高敏感性和时效性的流式微球技术检测血小板糖蛋白（GP）特异性抗体的方法，筛选GP特异性抗体阳性的患者，来诱导CD4+CD25- T细胞分化为GP特异性CD4+CD25+Foxp3+ iTreg，观察到与GP特异性iTreg作用后，ITP患者成熟DC表面CD83、CD86和HLA-DR表达显著降低，DC活化T细胞的能力显著降低，DC中DLL1、JAG2、Notch1、TGFbR3、SKIL和TAB1表达显著升高。以慢病毒为载体，干扰DC中的JAG2后，GP特异性iTreg作用后的DC免疫抑制功能减弱，T细胞恢复增殖，而干扰DC中的TGFbR3后，T细胞增殖仍然受到抑制，表明GP特异性iTreg诱导DC产生致耐受效应依赖于JAG2而不依赖于TGFbR3。以慢病毒在DC中过表达JAG2时，DC刺激T细胞增殖的能力减弱，而在DC中过表达TGFbR3时，T细胞增殖未受影响。上述实验结果表明，虽然我们前期PCR检测显示JAG2和TGFbR3在基因表达水平上与GP特异性iTreg诱导的DC发挥免疫耐受作用均呈正相关，但是，体外功能试验（干扰和过表达）证实，GP特异性iTreg诱导DC成为致耐受性DC只依赖于JAG2而不依赖于TGFbR3，很可能TGFbR3在DC产生致耐受性中是“果”而不是“因”，是继发于其他基因所发挥的作用。这说明，研究基因或信号通路的相关性时，基因表达和功能存在不一致性，不能单凭基因表达水平上的检测结果，而必须进行功能试验。这同时也促使我们增加动物实验（原计划书中不包括动物实验），以期在体内进一步验证JAG2在诱导免疫耐受中的作用。我们建立了ITP的主动型GPIIIa基因敲除小鼠模型，用野生型C57BL/6小鼠血小板免疫GPIIIa基因敲除(C57BL/6 CD61 KO)小鼠，选择抗GPIIIa 抗体高滴度小鼠，将其脾脏单个核细胞移植入放射线照射SCID小鼠，SCID小鼠血小板数目持续性减少，抗血小板抗体维持在较高滴度水平，较好地模拟了成人慢性ITP的疾病持续状态。我们已构建了小鼠JAG2逆转录病毒载体，目前正将其转染接受脾细胞移植的SCID小鼠，移植前及移植后每间隔7天从SCID小鼠隐静脉取血，进行血小板计数和抗血小板GPIIIa抗体检测（观察至移植后 5 周），研究结果将为ITP的免疫干预提供新靶点。