中文摘要：

DNA损伤检验点反应和损伤修复在维持细胞基因组稳定性和抑制细胞癌变中起着关键性的作用，其分子调控机制的阐明对于防癌抗癌有着重要的指导意义。近年的研究发现蛋白激酶AKT参与调控DNA损伤检验点反应和同源重组修复，然而其具体分子机理还很不清楚。我们在前期研究中发现蛋白激酶AKT在DNA损伤检验点反应和同源重组修复信号途径的多个信号分子上有潜在的磷酸化位点。高活性的AKT抑制这些信号分子在DNA损伤部位的募集并降低它们的稳定性，进而抑制损伤应答和修复。本项目将在上述基础上，从细胞水平和整体水平上研究AKT对DNA损伤检验点反应和同源重组修复信号通路的调控作用，探讨其作用靶点及调控机制。此外，AKT在很多恶性肿瘤中表达异常，AKT信号通路已经成为新一代抗肿瘤药物研究的重要靶点，本研究也为今后多靶点特异性治疗AKT活性异常的恶性肿瘤提供理论依据和潜在的临床意义。

结论摘要：

本研究计划拟以DNA损伤检验点反应和DNA修复信号途径为研究对象，探讨蛋白激酶AKT在该信号途径的作用靶点和调控机制。我们发现在PTEN敲除导致高AKT激酶活性的细胞中，DNA损伤诱导后细胞内ATR-Chk1信号通路的活性显著，并且ATR蛋白不能募集到DNA 损伤部位。抗磷酸化AKT底物抗体免疫沉淀实验结合质谱技术证实蛋白激酶ATR是AKT的磷酸化底物，其蛋白氨基端存在一个RRRLSSS的氨基酸序列为AKT的磷酸化位点。为了验证AKT磷酸化对ATR蛋白生物学功能的影响，我们构建了ATR真核表达质粒并对AKT磷酸化位点进行了定点突变。但突变质粒的表达量非常低，western blot几乎无法检测到突变蛋白的存在，因此我们对研究计划进行了必要的调整和变动。首先，我们研究了细胞周期蛋白激酶Chk1在细胞周期检验点的调控作用。Chk1蛋白本身也是一个AKT的靶蛋白，Chk1丝氨酸280位点 能够被AKT蛋白磷酸化，这种磷酸化修饰起着一种负调控作用因为磷酸化蛋白主要定位在细胞质中因此削弱了Chk1激酶的活性。已经有大量的文献证明Chk1在DNA损伤应答和损伤修复信号通路的作用，我们主要探讨了敲除Chk1基因对细胞有丝分裂进程和纺锤体检验点反应的影响。研究发现敲除Chk1基因抑制细胞有丝分裂进程和中期染色体重排，此外Chk1 还能通过调控Mad2和Cdc20蛋白的表达和亚细胞定位影响APC蛋白酶降解系统的活性，研究成果发表在Life Sciences杂志上。其次，我们发现一种微小核酸能够调节mTOR/AKT信号通路进而影响细胞周期的进程以及细胞自噬的活性。微小核酸MIR155抑制mTOR/AKT信号通路上三个信号分子包括RheB，Rictor和p70S6K的表达，这三种蛋白的下调导致mTOR及AKT蛋白激酶活性的降低，从而诱导细胞自噬活性，抑制细胞增殖和细胞周期从G1到G2期的转换过程，研究成果发表在Autophagy杂志上。