中文摘要：

植物双受精过程中，精子细胞只有通过花粉管导向才能准确到达胚囊。花粉管导向是高等植物完成双受精过程的重要环节，是受多重信号调控的复杂过程。最近的研究揭示了配子体阶段花粉管导向的诱导信号分子是一类具多态性的防卫素类似蛋白，但是对于花粉管中能够识别这些分子的受体仍缺乏认识。本项目拟通过1）建立拟南芥花粉管导向的半体外测试系统，收集顶端即将到达雌配子体珠孔的花粉管（处于特定信号传导阶段的花粉管）；2）利用芯片技术鉴定上述花粉管材料中特异表达的受体类激酶（RLK）基因；3）选定候选RLK基因并进行功能分析这一技术路线来揭示花粉管中识别助细胞分泌小分子蛋白信号的受体。以上研究，将为胚囊诱导分子的信号通路的认知提供更进一步的实验证据。

结论摘要：

我们在项目的执行过程中，严格按照项目计划书开展项目研究，较好的完成了项目目标，在一定程度上揭示了相关受体蛋白激酶，小分子分泌蛋白等分子在花粉管导向的信号传递的作用机理并发表了相关文章。 2011度年我们在实验室建立了花粉管的半体外导向系统（SIV-PG），完成了花粉管实验材料的收集和RNA样品的分离纯化，花粉(Pollen)，并选取Roche NimbleGen 32K芯片（包含39000基因），对花粉，体外培养花粉管（PT）和半体外花粉管（SIV-PG）的基因表达谱进行芯片比较分析。芯片结果真实可靠，重复性好；差异表达基因的Q-PCR分析进一步验证了芯片结果。芯片结果比较分析表明各材料间存在大量，丰富的差异表达基因。我们重点选取三类基因作为候选基因，第一类为受体激酶类基因；第二类为编码富含cysteine的DEFL-like基因，；第三类为编码disease resistance protein (TIR-NBS-LRR class)基因。 2012年度我们对上述候选基因进行了一系列功能分析实验，首先，从拟南芥生物资源中心（ABRC）获得了各自的T-DNA插入突变体并对所获得的突变体首先进行基因型和表型鉴定。其次，我们对这些候选基因的表达谱进行分析，利用这些基因的启动子驱动报告基因GUS的表达来鉴定基因的表达谱，最后我们还对候选基因利用RNAi技术降低其表达来研究其功能。但是由于受体激酶家族间的功能冗余，候选基因的单基因缺失突变体和RNAi转基因植株大多没有表型，必须选用其他策略进行功能分析。 2013年度我们使用Dominant-negative的技术方法来对一些受体激酶的激酶活性进行修饰，使植株能突破基因功能冗余的限制表现出相应表型。我们通过基因克隆的方法把候选受体激酶的激酶结构域缺失掉并携带FLAG标签，通过转基因的方法使这一缺陷蛋白在正常植株中表达，蛋白印迹实验验证受精缺陷的转基因植株中存在携带FLAG标签截短蛋白，从而从一个侧面证实受体类激酶在花粉管导向中的功能。另两类候选基因的功能研究还在继续中。对以上的实验结果，我们整理了三篇文章分别在SCI收录期刊Journal of Plant Biology 和国内优秀核心期刊中国生物化学与分子生物学报发表。