中文摘要：

D-氨基酸是天然L-氨基酸的对映体，是医药、农药及许多精细化工产品的重要中间体，可以通过化学或生物方法来获得。从反应原子经济学及温和反应条件的角度考虑，利用氨基酸脱氢酶催化酮酸还原胺化合成D-氨基酸是最理想的方法之一。天然D-氨基酸脱氢酶的研究较少，L-氨基酸脱氢酶的研究较多，且有严格的L-选择性，其反应平衡偏向于还原胺化，被用于L-氨基酸的合成，但没有它们手性选择性方面的研究。L-亮氨酸脱氢酶(LeuDH)是L-氨基酸脱氢酶的一种，其三维结构及催化机制和该家族其他酶类似。本项目以其为研究对象，通过结构模拟，推测出其结构上决定手性选择的区域，对该区域进行多位点饱和突变，筛选出能进行D-氨基酸合成的突变体；通过解析LeuDH野生型及突变体酶结合底物的三维结构，阐明L-氨基酸脱氢酶结构和手性选择性的关系，即手性选择机理。为改造L-氨基酸脱氢酶,获得进行D-氨基酸生产的高效催化剂提供理论依据。

结论摘要：

本项目通过对氨基酸脱氢酶的结构、改造研究，探讨了氨基酸脱氢酶的手性选择机理。本项目中主要研究了有严格手性选择性的L-氨基酸脱氢酶（EC.1.4.1.X)，以来源于Bacillus sphaericus ATCC4525中的Leudh为研究对象，对其进行结构模拟分析，找出了其可能和手性选择性相关的位点，通过多轮定向进化工作，成功筛选到对D-氨基酸有催化活力的突变体，三突变Glu114Gly/Asp115Trp/Asn287Glu以及Glu114Gly/Asp115His/Asn287Glu催化反应产物中D-氨基酸的ee值已经超过80%，并通过蛋白质结构模拟分析这些突变的分子结构，对它们手性选择性改变的机理进行了推测。在研究L-氨基酸脱氢酶工作的同时，我们以内消旋二氨基庚二酸脱氢酶为研究对象，从Clostridium tetani E88中挖掘出一个新的内消旋二氨基庚二酸脱氢酶CtDAPDH，将其改造为D-氨基酸脱氢酶。解析了CtDAPDH突变子浸泡底物的晶体结构，发现了突变对原始底物以及新的氨基酸底物的结合位置的影响。通过对这些氨基酸脱氢酶的改造、晶体学等工作，对氨基酸脱氢酶催化D-氨基酸的机理有了较深入认识，为后续继续拓展该家族酶在D-氨基酸合成方面的应用提供了理论依据。