在前期工作已检测到菊科植物中含甜菜碱醛脱氢酶(BADH)基因物种的基础上,进行盐诱导试验,通过Northern杂交筛选出能高效表达该基因的物种。继而利用逆转录扩增(RT-PCR)和快速扩增cDNA末端(RACE)技术,克隆全长cDNA。根据cDNA序列设计引物,通过反向PCR技术克隆该基因的启动子区域,对其结构进行分析,鉴定出对逆境胁迫做出反应的各种顺式作用元件,并将其与报告基因GUS结合构成表达构件导入菊花不同品种中,观察报告基因的表达规律,从而获得BADH基因启动子序列启动基因表达的信息。通过本项研究可找到高效表达BADH基因的菊科植物, 分离出知识产权归我国所有的BADH基因;分离出高效表达的启动子序列;构建可进行表达调控研究和转基因研究的质粒,为菊花及相关观赏植物转基因育种提供有效的基因构件。
在前期工作的已检测到菊科植物中含甜菜碱脱氢酶(BADH)基因物种的基础上,进行盐诱导试验,通过Northern杂交和甜菜碱含量的测定筛选出高效表达该基因的物种- - 甘菊。继而利用逆转录扩增(RT-PCR)和快速扩增cDNA末端(RACE)技术,克隆出甘菊中两个BADH基因cDNA全长序列,分别命名为DlBADH1和DlBADH2(登录号DQ011151和DQ011153)。根据cDNA序列设计引物,通过反向PCR技术获得了该基因的四个启动子序列,分别命名为DBP11、DBP12、DBP21、DBP22(登录号DQ497620-23),通过软件分析表明其上含有大量与干旱、盐、ABA诱导相关的顺式作用元件,将四个启动子与报告基因GUS融合构建植物表达载体,通过农杆菌介导法导入烟草中,对转基因烟草进行干旱、盐、ABA、SA胁迫处理,试验结果表明DBP11、DBP12、DBP21启动子对干旱、盐、ABA胁迫反应敏感,对SA胁迫没有响应,启动子DBP22对盐胁迫反应敏感,对其它胁迫处理没有响应。本项研究为菊花及相关观赏植物转基因育种提供了有效的基因构件。