中文摘要：

非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）发病机制不清且缺乏有效治疗方法。新近研究证实高脂饮食诱导的代谢性内毒素血症是其重要致病因素，其中脂多糖（LPS）刺激肝脏Kupffer细胞（KC）产生氧化应激，诱导NF-κB活化触发肝脏炎症和胰岛素抵抗（IR）是其发病最初始环节，而转录因子Nrf2是调节细胞内氧化应激的中心环节。我们前期研究发现，诱导Nrf2核转位能够抑制LPS刺激KC引起的氧化应激进而减轻炎症因子分泌。故此，本课题拟建立NALFLD小鼠模型，采用分子生物学方法动态观察LPS刺激KC 引起NF-κB活化对其下游炎症因子表达、肝脏IR的影响。分离培养KC及肝细胞，多种信号通路阻断剂抑制KC 的Nrf2核转位，研究Nrf2调节NF-κB对LPS刺激KC时炎症因子及肝脏IR的调节作用及机制，进而从KC角度阐明Nrf2对NAFLD的保护作用及机制有重要意义。

结论摘要：

氧化应激在非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）中发挥重要作用，氧化应激引起多种肝脏细胞受损和功能变化。高脂饮食诱导的代谢性内毒素血症是的重要因素，其中脂多糖（LPS）刺激肝脏Kupffer细胞（KCs）产生氧化应激，诱导NF-κB活化触发肝脏炎症和胰岛素抵抗（IR）是其发病最初始环节，而转录因子Nrf2是调节细胞内氧化应激的中心环节。本课题中，通过改进Akira等提出的KCs分离方法前灌注液在体灌注、Ⅳ型胶原酶离体灌注消化，Percoll分离液不连续密度梯度离心，获得活度和纯度均较高的KCs。通过检测细胞内DHE及肝脏丙二醛( MDA) 、谷胱甘肽( GSH)及胰岛素信号通路JNK/p-JNK 与IRS-1/p-IRS-1，证实Nrf2减轻葡萄糖氧化酶（GO）引起的LO2氧化应激和肝细胞受损，p-JNK水平增加 与p-IRS-1水平减低，Nrf2减轻两者的变化，Wortmannin部分阻断Nrf2核转位能够抑制Nrf2的这种效应，提示Nrf2可通过降低细胞氧化应激改善肝细胞IR。利用普通大鼠及Nrf2-/-小鼠建立高脂饮食NAFLD模型，通过检测氧化应激水平及胰岛素信号通路JNK/p-JNK 与IRS-1/p-IRS-1，证明单纯敲除Nrf2 对小鼠肝脏组织学无明显影响，而敲除Nrf2 可以明显加重高脂饮食诱导的肝脏脂肪沉积和炎症变化，增加肝脏NF-κB活化及炎症因子TNF-α 与IL-6 表达，Nrf2能够增加HO-1表达，减低高脂饮食引起的肝脏氧化应激水平及肝功受损，减轻肝脏p-JNK 水平升高、p-IRS-1水平显著降低。高脂饮食小鼠出现胰岛素抵抗（IR）时，Nrf2-/-小鼠脂质沉积和炎症变化更为明显，与Nrf2敲除可以显著加重高脂饮食诱导的肝脏氧化应激水平有关。采用慢病毒转染技术，分别转染大鼠肝星状细胞株HSC-T6和肝细胞株BRL-3A细胞， 筛选稳定Nrf2沉默或过表达表达细胞株，给予GO干预后，Nrf2在两种细胞株中都具有抗氧化应激作用，且这种保护作用可能是基于下调p66Shc和上调IQGAP1来实现的。GO干预肝星状细胞后导致氧化应激，促进α-SMA表达和ECM合成， Nrf2有效地抑制了GO引起的ROS水平增高及α-SMA表达和ECM合成。Nrf2能有效降低LPS诱导分离培养的大鼠KCs时氧化应激水平，进而减低LPS刺激KCs时TNF-α、IL-6