中文摘要：

肿瘤临床研究表明多靶点阻断的疗效要优于单靶点阻断，因此多靶点药物是今后抗肿瘤药物研究的发展方向。EGRF在多种肿瘤中都过表达，是公认的一个肿瘤治疗的靶点。CD13在肿瘤血管内皮细胞高表达，促进新生血管的形成，与肿瘤细胞的侵袭转移相关。单链抗体和靶向肽是靶向药物研究中应用较多的两类靶向分子，将其与活性蛋白融合，可以更好地发挥靶向杀伤作用。LDM是对肿瘤细胞杀伤作用最强的大分子肽类抗肿瘤抗生素，是靶向药物理想的"弹头"药物。本项目以抗EGFR单链抗体和多聚环状NGR为基础，根据LDM可拆分和重建的特性，采用基因重组和分子组装相结合的技术路线，制备一系列以EGFR和CD13为靶点的双靶点融合蛋白scFv-（NGR）3、scFv-LDP-（NGR）3和scFv-LDP-（NGR）3-AE。研究、比较三种融合蛋白的抗肿瘤细胞活性及作用机制，对基于单链抗体和靶向肽的双靶点抗肿瘤药物研究策略进行探讨。

结论摘要：

本项目成功制备了基于EGFR单链抗体、环状NGR肽和力达霉素的双靶点融合蛋白[ER(Fv)-NGR和ER(Fv)-LDP-NGR]、单靶点融合蛋白[ER(Fv)-LDP和LDP-NGR]以及强化融合蛋白[ER(Fv)-LDP-NGR-AE、ER(Fv)-LDP-AE和LDP-NGR-AE]，并对其抗肿瘤活性以及作用机制进行了研究。实验结果表明，ER(Fv)-NGR和ER(Fv)-LDP-NGR与EGFR/CD13高表达的肿瘤细胞有较强的结合能力，对肿瘤细胞的体外增殖具有抑制作用，IC50值介于10-7-10-6 mol/L；对人乳腺癌MCF-7裸鼠移植瘤的生长具有抑制作用，抑瘤率分别为45.4%和70.5%。与烯二炔发色团AE组装后，双靶点强化融合蛋白 ER(Fv)-LDP-NGR-AE显示更强烈的杀伤细胞活性，对于MCF-7细胞的IC50值为6.2×10-13 mol/L，细胞毒性强于单靶点强化融合蛋白 ER(Fv)-LDP-AE和LDP-NGR-AE以及力达霉素。双靶点强化融合蛋白ER(Fv)-LDP-NGR-AE对 MCF-7移植瘤的抑制作用更强，0.2 mg/kg剂量的抑瘤率为86.3%，高于等摩尔剂量的 ER(Fv)-LDP-AE（80.3%）、 LDP-NGR-AE（70.0%）以及力达霉素（65.3%）。ER(Fv)-LDP-NGR-AE对EGFR过表达的人鳞癌A431裸鼠移植瘤的抑制率为81.4%，也明显高于等摩尔剂量的单靶点药物以及力达霉素。ER(Fv)-LDP-NGR可引起细胞周期G2/M期阻滞，诱导细胞凋亡，抑制细胞迁移，降低EGFR mRAN及蛋白表达水平。ER(Fv)-LDP-NGR-AE能够通过调节肿瘤细胞信号通路，干扰细胞周期循环和诱导细胞凋亡；通过降低迁移能力和调节MMPs活性，阻碍肿瘤细胞的侵袭转移；抑制内皮细胞形成管腔结构。本研究为建立研制以单链抗体和靶向肽为靶向分子、力达霉素辅基蛋白为“支架”、烯二炔发色团为高效“弹头”的特异性抗体-药物偶联物的技术平台奠定了基础。本项目所涉及内容已发表SCI论文一篇，录用中文核心期刊论文两篇；两次在国内学术会议上进行学术交流。后续研究工作已获得“十二五”创新药物研究开发技术平台资助。