中文摘要：

VHL基因在多种人类肿瘤中功能失活，发挥肿瘤抑制作用。本研究的前期结果证明VHL在软骨肉瘤中缺失表达，且与病理分级和凋亡指数密切相关。超表达VHL显著抑制软骨肉瘤细胞生长，诱导细胞发生程序性细胞死亡，形态学的改变具有细胞凋亡的特征，这些效应与其抑制Wnt/β-catenin信号通路和上调Bax表达相关。本课题将在软骨肉瘤细胞和裸鼠移植瘤上进一步证实VHL对软骨肉瘤的靶向治疗作用，鉴定出VHL与Wnt/β-catenin信号通路上相互作用的蛋白分子；阐明VHL抑制β-catenin蛋白水平的分子调控机制及其对β-catenin依赖的下游功能的影响，如细胞凋亡与增殖等；证明VHL对β-catenin的功能性负向调节作用，阐明细胞内VHL-β-catenin/TCF蛋白之间调节网络在靶向软骨肉瘤治疗中的重要意义，为VHL 靶向软骨肉瘤治疗的临床应用奠定基础。

结论摘要：

VHL基因在多种人类肿瘤中功能失活，发挥肿瘤抑制作用。本课题首次发现 VHL基因在软骨肉瘤中功能失活，与软骨肉瘤的病理分级、细胞增殖、微血管生成、Bax表达及凋亡指数密切相关，阐明了VHL参与软骨肉瘤的发生发展，但VHL不能作为软骨肉瘤预后的分子标记物。 我们构建腺病毒VHL 重组表达载体（Ad5-VHL），分析其对软骨肉瘤的靶向治疗作用。CCK8 和软琼脂克隆形成实验证明 Ad5-VHL能以时间和浓度依赖性抑制软骨肉瘤细胞生长。Ad5-VHL显著诱导软骨肉瘤细胞凋亡，且激活Caspase-3 的活化和调控Bcl-2家族蛋白。进一步信号通路的研究表明，Ad5-VHL抑制活化的β-catenin表达，抑制β-catenin/TCF转录活性及其下游基因表达。应用dnTCF4或siLEF阻断β-catenin/TCF活性，能够显著增强pVHL介导的细胞生长抑制和凋亡。pVHL显著上调GSK-3β表达，而GSK-3β抑制剂SB-216373抑制活化的β-catenin表达及β-catenin/TCF活性，进而增强VHL介导的细胞生长抑制和凋亡。 进一步的蛋白-蛋白相互作用研究发现，VHL与Pin1相互作用，介导Pin1的泛素化和蛋白酶体降解。干扰或过表达Pin1则能显著增强或降低VHL抑制活化β-catenin、β-catenin/TCF转录活性及下游靶基因表达，提示VHL抑制经典Wnt/β-catenin信号通路是通过调节Pin1发挥作用。 在体内实验中，Ad5-VHL 能够显著抑制裸鼠移植瘤的生长，增加细胞凋亡。分子机制研究发现Ad5-VHL显著抑制Pin1的蛋白表达，抑制活化β-catenin表达及其下游基因表达。同时，我们对裸鼠的一般情况进行了观察，对裸鼠的肝脏、脾脏、心脏、肾脏等脏器进行了病理分析，发现 Ad5-VHL对裸鼠机体重要器官没有明显的毒副作用，说明 Ad5-VHL 在动物体内治疗的安全性。 综上所述，Ad5-VHL能够在体内外显著抑制软骨肉瘤细胞生长、诱导凋亡，其分子机制至少是通过与Pin1相互作用，介导Pin1的泛素化降解，功能性抑制经典Wnt/β-catenin信号通路，激活Caspase-3 的活化和调控Bcl-2家族蛋白来发挥作用，这为 Ad5-VHL靶向治疗软骨肉瘤的潜在的临床应用奠定基础。