中文摘要：

分别以猪繁殖与呼吸综合征病毒结构蛋白基因、复制酶基因，非编码调控序列为靶序列，设计干扰RNA序列，PCR扩增法构建干扰RNA表达盒，转染细胞，筛选有效RNA干扰序列，再构建干扰RNA表达载体，分别转染细胞，检测病毒结构蛋白与结构蛋白基因表达水平，以评价抑制病毒复制效果。本研究采用最新的RNA干扰技术，不同于传统的免疫学途径，有望克服猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体依赖性增强作用给防治本病带来的障碍。同时

结论摘要：

本研究利用一步PCR法扩增产生包含鼠U6启动子的shRNA表达盒，带shRNA表达盒的PCR产物分别与表达PRRSV N蛋白的重组质粒pEGFP-ORF7共转染293T细胞，建立了快速筛选高效干扰目的基因表达的siRNA靶位点的方法。将筛选出的靶位点运用PCR扩增表达盒和构建表达shRNA质粒两种方法分别对PRRSV在MARC-145细胞内复制的抑制效果进行了研究。对病毒蛋白水平与mRNA水平的检测均表明N179位点最为有效，pEN179-shRNA处理组病毒渡度比对照组低681倍。为了了解次要结构蛋白GP2、GP3、GP4在病毒复制中的作用，针对各基因分别选取4个siRNA位点，构建相应的shRNA表达载体。荧光定量PCR筛选可以减少PRRSV感染MARC-145细胞中的GP2、GP3、GP4相应mRNA含量的特异shRNA表达载体，病毒效价滴定表明这些shRNA表达载体处理细胞培养上清中的病毒滴度比对照低184至4.65倍，但免疫荧光检测中没有发现明显差异，表明次要结构蛋白在病毒感染中有重要作用。