中文摘要：

艰难梭菌是医院内感染的主要病原菌之一，近年来，由于高致病菌株的出现、菌株耐药性的增加，艰难梭菌感染在全球呈蔓延趋势，表现为爆发流行、病人年轻化、由院内感染向社区传播的流行特征。由于缺乏有效的疫苗，使得这一疾病的防治成为目前公共卫生的难题之一。在前期研究的基础上，本项目将通过艰难梭菌的透析培养，收集菌体、同时采用盐析、层析等方法纯化艰难梭菌A、B毒素，制备菌苗抗原和类毒素抗原，分别免疫产蛋鸡，获得卵黄，并从中纯化提取特异性抗菌IgY、和抗毒素IgY，然后一方面应用抗毒素IgY为捕捉抗体、单克隆抗体为酶标记抗体来研究其诊断价值；另一方面通过研究抗菌IgY或/和抗毒素IgY对艰难梭菌感染的小鼠肠道黏膜素损伤及相关炎症因子表达的影响，进一步揭示艰难梭菌肠道感染的相关机制。针对国内外艰难梭菌感染的防控现状，不仅探索一种新的防治艰难梭菌感染的非抗生素途径，也为艰难梭菌类毒素疫苗的研制提供技术和材料。

结论摘要：

艰难梭菌是医院内感染的主要病原菌之一，近年来，由于高致病菌株的出现、菌株耐药性的增加，艰难梭菌感染在全球呈蔓延趋势，由于缺乏有效的疫苗，使得该病的防治成为目前公共卫生的难题之一。 (1) 本项目首先通过艰难梭菌的透析培养，收集菌体、同时采用盐析、离子交换层析等方法纯化艰难梭菌A、B 毒素，用0.4%甲醛溶液制备类毒素（A毒素、B毒素、A+B毒素）抗原和菌苗抗原。 (2) 用纯化的B毒素免疫BALB/C小鼠，经与骨髓瘤细胞杂交获得3株杂交瘤细胞，产生的单克隆抗体分别为IgG和IgM，单克隆抗体的获得无论在艰难梭菌的预防及临床实验室诊断方面都有重要的意义。 (3) 成功制备了检测艰难梭菌B毒素的ELISA诊断试剂盒。最低可检出艰难梭菌B毒素1ng/ml。初步表明这种艰难梭菌B毒素的单克隆抗体酶标诊断试剂盒具有较好的特异度和灵敏度。检测发现，兰州地区的206例腹泻患者的粪便标本细胞毒试验检测感染率为12.62%（26/206），该结果对于了解国内艰难梭菌感染的现况无疑有一定的参考价值。 (4) 用类毒素（A毒素、B毒素、A+B毒素）抗原和菌苗抗原。加入弗氏佐剂，分别免疫产蛋鸡，收集鸡蛋，并从卵黄中纯化提取特异性抗A毒素IgY、抗B毒素IgY、抗A+B毒素IgY以及抗菌IgY。60%硫酸铵盐析、Sephacryl-S300分子筛层析，最后用40%饱和度的硫酸铵盐析后4℃保存。 (5) 纯化的IgY具有良好的稳定性，可耐受pH范围内对酸碱、50℃30min。 (6) 取Lovo 细胞粘附实验证实，分别加入不同浓度的纯化的IgY和艰难梭菌, 革兰染色镜检，结果发现抗菌IgY对艰难梭菌的粘附具有显著的抑制作用。用异硫氰酸荧光素(FITC)标记艰难梭菌VPI10463，分别用含不同浓度的纯IgY的PBS 悬浮, 以流式细胞仪测定肠上皮细胞结合的艰难梭菌的相对荧光强度，显示艰难梭菌粘附肠上皮可被抗菌IgY抑制。 (7) 通过检测TNF-α、体内D2乳酸、二胺氧化酶( diamine oxidase, DAO)的表达的影响作用，发现IgY能有效缓解艰难梭菌感染模型小鼠的肠黏膜观察肠粘膜通透性和病理改变，能有效降低炎症因子的释放。针对国内外艰难梭菌感染的防控现状，项目的结果为不仅为艰难梭菌类毒素疫苗的研制提供技术和材料，也提示IgY有望成为防治艰难梭菌感染的（非抗生素）新制剂。